山茶組織培養(yǎng)體系的建立me

山茶花組織培養(yǎng)體系的建立主講：小組人員：李小龍、付正紅、孔博、趙余慶、唐敬偉、潘海軍、石春美、楊文祥《山茶》

宋陸游

東園三月雨兼風，桃李飄零掃地空。唯有山茶偏耐久，綠叢又放數(shù)枝紅。

經(jīng)分析我國茶花業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和存在的問題,為適應(yīng)市場需要，那么使用組織培養(yǎng)這種快速繁殖方式是一定的。就此，我們小組重點介紹山茶花組織培養(yǎng)的過程和在組織培養(yǎng)過程中存在的問題及解決方法。

一、山茶花簡介山茶花為山茶科山茶屬常綠灌木或喬木,喬木類樹高可達12m,別名茶花、耐冬、晚山茶、川茶,產(chǎn)地有中國、朝鮮、日本等,但大多數(shù)產(chǎn)于中國。山茶花花朵大,花色豐富艷麗,在國際花卉界享有盛名,與著名的觀賞花卉如月季、菊花等同屬世界級名花,深受各國人民的喜愛。山茶花的一些種類還是重要的用材樹種、油料植物和飲料植物。近年來,一些山茶屬植物的藥用保健功能得到越來越深入廣泛的開發(fā)利用。山茶花傳統(tǒng)的繁殖方法主要有播種、嫁接、扦插及壓條等方式,但因其生根較困難和繁殖率低等原因,很難滿足山茶屬植物苗木市場的需要。特別是一些名貴或珍稀的品種類型,由于其育性差,一般不結(jié)種子,扦插繁殖生根率很低,嚴重制約了山茶花的發(fā)展。因此,山茶花種苗的組織培養(yǎng)快速繁殖被認為是一種可以大大提高繁殖系數(shù)和加速山茶花種植發(fā)展的技術(shù)方法,且對一些優(yōu)良品種和珍稀品種的保護具有重要意義。二、山茶花的組織培養(yǎng)

1、培養(yǎng)材料的選擇選擇成年山茶花的莖尖與帶芽莖節(jié)段

2、初代培養(yǎng)（誘導(dǎo)愈傷組織）

①配制分生培養(yǎng)基：WPM培養(yǎng)基＋1毫克／升BA＋0.01毫克/升IBA，PH5.2。

②外植體預(yù)處理：從成年山茶樹冠的頂部剪取著生葉芽的一年生枝條，采下的枝條進行水插，置于生長室中，促使葉芽萌發(fā)為嫩梢，在嫩梢長2～4厘米時切下作外植體。也可在4～5月在同株樹上取相同長的當年嫩梢直接作外植體。外植體處理：把試驗材料切成長2～3cm的帶芽或莖尖的嫩莖段,用洗衣粉水刷洗材料表面的污垢后,流水沖洗干凈備用。

③表面消毒：嫩梢先用70％酒精浸泡30秒，接著在5％的次氯酸鈣溶液中浸泡5分鐘，無菌水沖洗3次，時間分別為30秒、20秒、10秒。然后將其切成長1~1.15cm的節(jié)段，作為初代外植體。

④接種：將在超凈工作臺上消毒滅菌處理后的外植體接種于相應(yīng)培養(yǎng)上，放置于光照培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)愈傷組織形成。3、繼代培養(yǎng)

（1）配制繼代培養(yǎng)基：WPM培養(yǎng)基+2毫克/升BA+0.01毫克/升IBA+2毫克/升ZT+2毫克/升2iP+30克/升蔗糖+6克/升瓊脂，PH=5.2。

（2）在超凈臺上將愈傷組織轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基上，放置在光照培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)芽的形成。

（3）在培養(yǎng)過程中應(yīng)控制褐化的發(fā)生。減少褐化的方法：用1‰抗壞血酸處理莖段及芽尖外植體、在培養(yǎng)基中加入一定比例的活性碳、在莖段外植體行接種前再剪去一部分莖段、對外植體勤轉(zhuǎn)瓶等措施莖段外植體在黑暗條件下培養(yǎng),用1‰抗壞血酸處理莖段及芽尖外植體、在培養(yǎng)基中加入一定比例的活性碳、在莖段外植體行接種前再剪去一部分莖段、對外植體勤轉(zhuǎn)瓶等措施。

4、生根培養(yǎng)

（1）配制生根培養(yǎng)基：大量元素減半的WPM培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)基中不含生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（植物激素及人工和成的激素類似物）（或者：莖尖為材料，誘導(dǎo)、繼代（叢生芽）培養(yǎng)基為MS+BA2.5mg/l（以下單位同）+IAA1.5，生根：1/2MS+IBA0.5或1/2MS+NAA4-8，添加水解酪蛋白分化效果更好。）

（2）將長出芽的愈傷組織轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基上，光照處誘導(dǎo)根的形成。培養(yǎng)條件：溫度：晝25℃，夜18℃；光周期：每天16小時光照，光照度3000勒克斯。

5、操作過程

為了獲得適合于增殖的培養(yǎng)體，在一個月內(nèi)將外植體轉(zhuǎn)移到相同成分的新鮮的培養(yǎng)基上3次，這對于誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織、脫分化、誘導(dǎo)分化出芽是有必要的。在轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基4周后，將培養(yǎng)體轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，新鮮培養(yǎng)基中除BA，ZT和2ip的濃度減至1毫克/升外，其它成分相同。更換新培養(yǎng)基的工作一般每4周進行一次。在增殖芽從增殖培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上之前，先將增殖芽的基部在1克/升的鐵IBA溶液中浸泡15分鐘，在接種到生根培養(yǎng)基上后，先將其放在黑暗條件下12天，進行暗處理。

6、煉苗和移栽

總的來說，當試管苗長出根但尚未老化前，打開瓶蓋放在陽光充足處讓其鍛煉1～2天，然后取出幼苗用溫水將瓊脂洗掉，移栽到消毒過的基質(zhì)中。移栽時要注意不要傷根并使其處于伸展狀態(tài)，澆透水后，用塑料薄膜覆蓋，保持空氣的相對濕度在90％以上，溫度在25℃左右，過一星期后逐步通氣并澆灌適量的水。（1）煉苗

：將瓶蓋打開，打破無菌環(huán)境，濕度逐漸下降，光照逐漸加強，使之形成新的功能強的根和葉片。（2）移栽移栽時應(yīng)注意的問題a、防止菌類滋生①苗底部培養(yǎng)基要洗干凈

②殺菌劑處理苗的根部

③定時用殺菌劑處理種植基質(zhì)b、保持小苗水分供給平衡

在移栽后5-7d內(nèi)，應(yīng)給予較高的空氣濕度條件（90%），使葉面的水分蒸發(fā)減少，盡量接近培養(yǎng)瓶的條件，讓小苗始終保持挺拔的狀態(tài)。

c、移栽時選擇合理的種植基質(zhì)

基質(zhì)要疏松透氣，有適宜的保水性，易于滅菌處理，不利于雜菌滋生：常用珍珠巖，椰糠，蛭石，細沙，泥炭、鋸木屑等。d、注意一定光照，溫度條件

試管苗移栽以后要保持一定的溫光條件，適宜的生根溫度是18—20℃，冬春季地溫較低時，可用電熱線來加溫。溫度過低會使幼苗生長遲緩，或不易成活。溫度過高會使水分蒸發(fā)，從而使水分平衡受到破壞，并會促使菌類滋生。

7、觀察項目

在實驗中記錄涉及內(nèi)容如下：

①接種的數(shù)量和日期。

②培養(yǎng)過程中是否出現(xiàn)污染、壞死、褐化，以及出現(xiàn)的時間、數(shù)量。

③愈傷組織胚狀體不定芽腋芽出現(xiàn)的時間誘導(dǎo)率以及生長情況。8、組織培養(yǎng)注意事項

（1）培養(yǎng)材料的選擇，需要選擇生長較好的材料。（2）植物材料的滅菌，要根據(jù)不同的材料來確定，材料允許的話，可以設(shè)計實驗取得最佳的滅菌處理。（3）培養(yǎng)基的配置。要根據(jù)不同的材料，不同的物種，選擇合適的培養(yǎng)