第9章胚胎培養(yǎng)與人工種子

第九章

植物胚胎培養(yǎng)與人工種子第一節(jié)植物胚胎培養(yǎng)第二節(jié)人工種子第一節(jié)植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)包括幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)和試管受精等內(nèi)容。植物胚胎結(jié)構(gòu)一、胚胎培養(yǎng)概念1、胚胎培養(yǎng)指使胚或具胚器官在離體無菌條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)。廣義胚胎培養(yǎng)研究還包括胚乳培養(yǎng)和試管受精等技術(shù)。胚電鏡掃描圖片2、胚培養(yǎng)指在無菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來，置于培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)的方法。雙子葉植物胚3、胚乳培養(yǎng)指處于細胞期的胚乳組織的離體培養(yǎng)。4、胚珠培養(yǎng)指未受精或受精后的胚珠離體培養(yǎng)。不同植物的胚珠形態(tài)結(jié)構(gòu)倒生胚珠5、子房培養(yǎng)指授粉和未授粉的子房培養(yǎng)。它對于研究果實發(fā)育的生理、離體受精等有重要意義。6、試管受精指在無菌條件下培養(yǎng)離體的未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌發(fā)產(chǎn)生的花粉進入胚珠而完成受精過程。二、胚胎培養(yǎng)的應(yīng)用1、克服遠緣雜交的不育性，獲稀有雜種植物2、打破種子休眠，提早結(jié)實，縮短育種年限3、使生活力低下或無生活力的種子萌發(fā)4、使柑橘類植物合子胚正常發(fā)育5、測定種子生活力6、獲三倍體或單倍體植株7、快速繁殖特殊植物8、用于理論研究指在無菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來，置于培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)的方法。三、胚的培養(yǎng)植物胚結(jié)構(gòu)胚電鏡掃描圖片雙子葉植物胚幼胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)

據(jù)培養(yǎng)目的不同剝?nèi)〉碾x體胚發(fā)育時期的不同胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)一般較易獲得成功（一）幼胚培養(yǎng)幼胚完全是異養(yǎng)的，離體條件下培養(yǎng)要求培養(yǎng)基成分復(fù)雜，培養(yǎng)不易成功。

幼胚培養(yǎng)時，其發(fā)育過程有以下幾種發(fā)育方式：a、胚性發(fā)育，此種方式不能萌發(fā)成苗b、早熟萌發(fā)，長成的苗十分瘦弱c、產(chǎn)生愈傷組織，再由愈傷組織分化形成胚或不定芽（二）成熟胚培養(yǎng)成熟胚是自養(yǎng)的，培養(yǎng)基需要簡單。主要目的:◆研究胚發(fā)育過程的形態(tài)建成◆生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用◆胚與胚乳相互關(guān)系和營養(yǎng)要求培養(yǎng)方法：A、將受精后成熟或未成熟種子或果實，用70%—75%酒精表面消毒消毒幾分鐘B、用0.1%升汞溶液或飽和漂白粉溶液消毒10min，無菌水反復(fù)沖洗C、無菌操作臺上，直接或在解剖鏡下剝?nèi)∨呓臃N在培養(yǎng)基上

胚齡胚長度（μm）營養(yǎng)需要（培養(yǎng)基營養(yǎng)）早球形胚后球形胚心形胚魚雷胚成熟胚20~6061~8081~450451~700700（最大極限）小于40μm長的胚所需營養(yǎng)尚不清楚大量元素、微量元素、VB1、VB6、煙酸、糖2%、IAA0.1mg/L+KT0.01mg/L大量元素、微量元素、VB1、VB6、煙酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、KH2PO442mg/L、VB1、VB6、煙酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、糖2%薺菜不同發(fā)育時期胚培養(yǎng)的營養(yǎng)需要胚乳是由兩個單倍的極核和一個單倍的精子結(jié)合而成的3倍體組織。由它可獲得無子結(jié)實的3倍體植株，進而可將它加倍成6倍體植株。

不同胚乳發(fā)育類型及發(fā)育時期直接影響外植體取材時期以及胚乳細胞產(chǎn)生愈傷組織頻率。胚乳培養(yǎng)的后代，常發(fā)生細胞染色體數(shù)目變化，形成多倍體、非整倍體等。四、胚乳培養(yǎng)1、核型胚乳

◆被子植物中普遍的胚乳發(fā)育形式◆初生胚乳核的第一次分裂和以后的多次分裂，都不伴隨壁的形成◆各個胚乳核呈游離狀態(tài)分布在胚囊中◆發(fā)育到一定階段后，常在胚囊外圍的胚乳核之間出現(xiàn)細胞壁

◆為單子葉植物和具有離瓣花的雙子葉植物中普遍存在，如小麥、水稻、玉米、棉花、油菜、蘋果等（一）胚乳的發(fā)育類型2、細胞型胚乳

特點：◆初生胚乳核的分裂開始，即產(chǎn)生細胞壁，形成胚乳細胞◆無游離核時期大多數(shù)雙子葉合瓣花植物是這樣的胚乳，如番茄、煙草、芝麻等。3、沼生目型胚乳

◆核型胚乳與細胞型胚乳的中間類型◆初生胚乳核的第一次分裂將胚囊分隔為兩室，其中珠孔端室比合點端室寬大◆核進行分裂形成狀態(tài)的游離核，最后形成細胞（二）胚乳培養(yǎng)的關(guān)鍵A、胚乳發(fā)育時期的影響發(fā)育早期胚乳：操作不便，誘導(dǎo)率低游離核期或剛轉(zhuǎn)入細胞期的核型胚乳：難得callus旺盛生長期胚乳：易誘導(dǎo)產(chǎn)生callus★旺盛期胚乳特征

§胚已分化完成

§胚乳已形成細胞組織

§充分生長，達到成熟大小

§外觀為半透明的固體狀

§富有彈性水稻：授粉后4d黑麥草：授粉后8~10d黃瓜：授粉后7~16d梨：授粉后20d大麥：授粉后10~20d玉米和小麥：授粉后8~12d一些草本植物胚乳培養(yǎng)的適宜取材時期一般情況下：接近成熟或完全成熟的胚乳callus誘導(dǎo)率很低，甚至無callus木本植物，如：桑寄生科、檀香科植物，其成熟胚乳和誘導(dǎo)產(chǎn)生callusB、培養(yǎng)基和激素的影響培養(yǎng)基：MS、B5、MT、White、LS等水解酪蛋白、酵母提取物也很必要

激素：要求特殊大麥胚乳只有在添加2，4-D的培養(yǎng)基上才能生長獼猴桃胚乳培養(yǎng)中，玉米素最好棗的胚乳培養(yǎng)中，激素似乎無特殊要求C、其他因素的影響蔗糖濃度：3%~5%溫度：25℃pH值：如玉米6.1~7.0；蘋果6.0~6.2等（三）培養(yǎng)方法：A、取授粉4-8d后的幼果，常規(guī)消毒B、無菌條件下切開果實，取出種子，分離出胚乳C、接種在培養(yǎng)基上，在25-27℃和黑暗條件或散射光下培養(yǎng)形成愈傷組織D、轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上，待愈傷組織長出芽后，切下不定芽E、插入生根培養(yǎng)基中，光下培養(yǎng)10-15d，切口處長出白色的不定根※兩種植物胚乳培養(yǎng)的方法A、枸杞開花20d的枸杞胚乳MS+2，4-D0.2mg/L生根MS分化出苗MS+BA0.2mg/L不同倍性的胚乳植株callusB、葡萄取出種子切去合點部分接種White+CM10%+2，4-D2.0+CH500+KT1.0+蔗糖3%~4%瓊脂8%1個月，胚乳愈傷組織長大，胚解體未授粉胚珠和子房培養(yǎng)是離體受精的基礎(chǔ)，可誘發(fā)大孢子發(fā)育成單倍體植株，且孤雌產(chǎn)生的單倍體植株獲得率較孤雄生殖高。胚珠培養(yǎng)中，已授粉具有球形胚或更后期的胚珠易培養(yǎng)成種子，且培養(yǎng)基及添加成分相對要求不高。而受精不久的胚珠則需要成分復(fù)雜的培養(yǎng)基，培養(yǎng)難度大。

五、胚珠和子房培養(yǎng)1、胚珠培養(yǎng)的意義有利于合子和早期原胚的培養(yǎng)胚分化不全的種子的胚培養(yǎng)獲得雜交后代和優(yōu)良品種離體授粉的需要獲得無病毒苗（一）胚珠培養(yǎng)不同植物的胚珠形態(tài)結(jié)構(gòu)2、胚珠培養(yǎng)的方法長度小于3mm的胚珠，難與直接解剖，可先接種于液體培養(yǎng)基中，根據(jù)培養(yǎng)情況采取相應(yīng)培養(yǎng)條件。（二）子房培養(yǎng)1、子房培養(yǎng)的意義

★有效地挽救雜種胚的敗育★單倍體植株的培育★離體授粉的需要★離體條件形成果實★花被功能研究2、子房培養(yǎng)的方法授粉或授粉后的子房表面消毒接種培養(yǎng)受精后的子房仍需進行表面消毒后再接種。而未受精子房可將花被表面消毒后，在無菌條件下直接剝?nèi)∽臃拷臃N。子房培養(yǎng)只需較簡單的培養(yǎng)基即可形成果實，并含成熟種子。六、植物離體授粉受精離體受精技術(shù)的突破的技術(shù)前提：a、雌配子和雄配子分離技術(shù)b、單對原生質(zhì)體融合技術(shù)c、微培養(yǎng)技術(shù)開花前數(shù)天套袋，開花前一天或當天取花蕾或花藥，表面消毒后，無菌條件下收集花粉。采用直接引入法、注射法進行子房試管授粉，或者是采用哺育法、接近法進行胚珠試管授粉。1、離體受精方法胚珠花粉試管內(nèi)授粉10d后胚珠培養(yǎng)3周后離體受精及植株再生過程2、技術(shù)關(guān)鍵A、花粉的采集和滅菌

★確定開花、花藥分裂、授粉、花粉管進入胚珠和受精作用時間★去雄后將花蕾套袋隔離★采集花粉?！锵尽餆o菌條件分裂花粉★授粉B、外植體選擇★開花前套袋、去雄★開花后1~2d，采集花蕾，放入無菌室培養(yǎng)準備★切去柱頭，防止不授粉★胚珠剝離時間（開花后1~2d效果好）C、適合的培養(yǎng)基離體受精的主要過程⊙花粉的萌發(fā)和花粉管的生長，受精⊙受精胚珠發(fā)育為成熟的種子，存在生活力的胚培養(yǎng)基應(yīng)促進受精后的胚珠正常發(fā)育離體受精胚珠培養(yǎng)的改良Nitsch（1951）培養(yǎng)基配方成分數(shù)量（mg/L）成分數(shù)量（mg/L）成分數(shù)量（mg/L）Ca（NO3）24H2O500ZnSO47H2O0.5VB10.25KNO3125MnSO44H2O3.0VB60.25KH2PO4125H3BO30.5煙酸1.25MgSO47H2O125FeC6O5H75H2O10.0蔗糖50000CuSO45H2O0.025Gly7.5瓊脂7000Na2MoO40.025泛酸鈣0.25蔗糖濃度是4%~5%，水解酪蛋白為500mg/L，利于花粉萌發(fā)和種子發(fā)育3、離體受精障礙★花粉在柱頭上不萌發(fā)★花粉管不能進入胚珠★花粉在花柱中破裂★受精后，胚和胚乳之間的不親和性★受精后，胚乳發(fā)育不良★雜種胚不能發(fā)育成熟七、影響因素1、胚珠（子房）的成活率及育齡離體胚珠（子房）培養(yǎng)的成活率直接影響試管受精的成功率。胚珠（子房）離體成活率的關(guān)鍵是培養(yǎng)基成分的篩選。2、母體組織的影響柱頭可影響某些植物受精，應(yīng)切除柱頭和花柱。而有些植物則需要保留，更有利于離體受精，如煙草。3、花粉萌發(fā)和花粉管生長離體花粉萌發(fā)率和花粉生長速度直接影響試管受精成功率。

胚齡胚長度（μm）營養(yǎng)需要（培養(yǎng)基營養(yǎng)）早球形胚后球形胚心形胚魚雷胚成熟胚20~6061~8081~450451~700700（最大極限）小于40μm長的胚所需營養(yǎng)尚不清楚大量元素、微量元素、VB1、VB6、煙酸、糖2%、IAA0.1mg/L+KT0.01mg/L大量元素、微量元素、VB1、VB6、煙酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、KH2PO442mg/L、VB1、VB6、煙酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、糖2%薺菜不同發(fā)育時期胚培養(yǎng)的營養(yǎng)需要第二節(jié)人工種子一、人工種子的概念人工種子是指植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體或不定芽包裹在含有養(yǎng)分和保護功能的人工胚乳和人工種皮中所形成的能發(fā)芽出苗的顆粒體。二、人工種子的類型及結(jié)構(gòu)1、人工種子主要包括：a、裸露的或休眠的、經(jīng)過或未經(jīng)過干燥處理的繁殖體b、用聚氧乙烯等多聚體包裹的繁殖體c、用水凝膠包裹的繁殖體d、液膠包埋的、用流質(zhì)播種法播種的體細胞胚2、人工種子的結(jié)構(gòu)（1）胚狀體（或芽）人工種子的胚主要是指體細胞胚，此外還有頂芽、腋芽、小鱗莖等也可以做為人工種子的胚。（2）人工種皮特點：

◆對胚狀體或芽無毒害◆柔軟且有一定機械抗壓能力◆能保持一定水分及營養(yǎng)物◆允許種皮內(nèi)外氣體交換通暢◆不影響胚萌發(fā)突破◆播種后易于化解

目前人工種皮常選用的材料有藻酸鹽等水凝膠、瓊脂糖、角叉膠等。（3）人工胚乳

胚乳是胚胎發(fā)育的營養(yǎng)條件，因此人工胚乳的基本成分仍是胚發(fā)育所需各類營養(yǎng)成分，此外，還可根據(jù)需要添加激素、抗生素、農(nóng)藥等成分，以提高人工種子的抗性與品質(zhì)。人工種子1、人工種子結(jié)構(gòu)完整，體積小，便于貯藏與運輸，可直接播種，易于機械化操作；2、不受季節(jié)限制，不受環(huán)境制約，胚狀體數(shù)量多、繁殖快、有利于工廠化生產(chǎn)；三、人工種子的意義3、有利于繁殖生育周期長、自交不親合、珍貴稀有的一些植物，也可大量繁殖無病毒材料；4、可在人工種子中加入抗生素、農(nóng)藥、菌肥等成分，提高種子活力和品質(zhì)；5、體細胞胚由無性繁殖體系產(chǎn)生，可以固定雜種優(yōu)勢。四、人工種子技術(shù)1、胚狀體誘導(dǎo)控制體細胞胚狀體同步發(fā)育是制備人工種子的核心問題，可采取抑制劑法、低溫法、滲透壓法、通氣法、分離過篩法等方法促進胚狀體同步生長。2、人工種皮制作

早期的材料是聚氧乙烯，但有一定的毒性且遇水易溶解。后來采用藻酸鹽較多，但易粘連、失水干縮，現(xiàn)在普遍采用在其外面加一層包裹劑如滑石粉、5%CaCO3等的方法來克服。3、人工胚乳的研制

人工胚乳主要包括無機鹽、糖（或淀粉）、蛋白質(zhì)等成分。對于無胚乳植物的人工種子制作必須加入糖分，同時也要加入防腐劑、抗菌素、農(nóng)藥等。4、包埋技術(shù)