PCR的種類及應用

PCR的種類及應用

序2023/2/41

PCR的歷史操作過程引物步驟

PCR的各種變體PCR的應用鑒定基因親子鑒定診斷遺傳病克隆基因誘變分析遠古DNA鑒定特定表型的突變體基因比較基因表達量

目錄2023/2/43PCR這項技術是由凱利·穆利斯(KaryMullis)發(fā)明，并因此在七年之后，1993年10月，獲得了諾貝爾化學獎該項殊榮。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，和反復相同程序的方法，并利用一種特殊的酶——即DNA聚合酶來擴增特定的DNA片段。PCR歷史2023/2/4DNA的復制DNA在復制時，雙鏈DNA解旋成兩股分別進行。其復制過程的復制起點呈現(xiàn)叉子的形式，故稱復制叉。以復制叉向前移動的方向為標準，一條模板鏈為3’—〉5’走向，在其上DNA能以5’—〉3’方向連續(xù)合成，稱為前導鏈(leadingstrand)；另一條模板鏈為5’—〉3’走向，在其上DNA也是5’—〉3’方向合成，但與復制叉移動的方向正好相反，故隨著復制叉的移動形成許多不連續(xù)的岡崎片段，最后在連成一條完整的DNA鏈，該鏈稱為后隨鏈(laggingstrand)。2023/2/45

①5’→3’的聚合作用：不是復制染色體而是修補DNA，填補DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性：消除在聚合作用中摻入的錯誤核苷酸。③5’→3’外切酶活性：切除受損傷的DNA，可用于切口平移（nicktranslation).

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一個片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。它可用于填補DNA單鏈末端成為雙鏈。DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶是從一種水生棲熱菌(Thermusaquaticus)yT1株分離提取的.yT是一種嗜熱真菌，能在70-75℃生長.存在于水生嗜熱菌(Thermusaquaticus)的嗜熱DNA聚合酶，可在74℃復制DNA，在95℃仍具有酶活力。該酶可在離體條件下，以DNA為模板，延伸引物，合成雙鏈DNA。這個酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。該酶基因全長2496個堿基，編碼832個氨基酸，酶蛋白分子為94KDa.其比活性為200000單位/mg.75～80℃時每個酶分子每秒鐘可延伸約150個核苷酸，70℃延伸率大于60個核苷酸/秒，55℃時為24個核苷酸/秒.溫度過高(90℃以上)或過低(22℃)都可影響TaqDNA聚合酶的活性，該酶雖然在90℃以上幾乎無DNA合成，但確有良好的熱穩(wěn)定性，在PCR循環(huán)的高溫條件下仍能保持較高的活性.TaqDNA聚合酶2023/2/47PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈式反應，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增。它可以在試管里建立反應，經過數(shù)小時之后，就能將極微量的目的基因或者某一特定的DNA片段擴增數(shù)十萬倍，乃至千百萬倍，而無需通過繁瑣費時的基因克隆程序，便可獲得足夠數(shù)量的精確的DNA拷貝，所以有人亦稱為無細胞的分子克隆法。PCR的定義PCR操作過程1、預變性（Initialdenaturation）．模板DNA完全變性對PCR能否成功至關重要，一般95℃加熱3-5分鐘。2、引物退火（Primerannealing）退火溫度一般需要憑實驗（經驗）決定。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。3、引物延伸引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。延伸時間隨擴增片段長短而定。4、循環(huán)中的變性步驟循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性：變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。5、循環(huán)數(shù)大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過多易產生非特燉條帶6、最后延伸在最后一個循環(huán)后，反應在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產物退火成雙鏈。引物設計設計引物可以采取以下原則：GC所占比例為40％－60％兩個引物的Tm，相差小于5℃，并且擴增產物的Tm與引物的相差不超過10℃。黏合溫度通常比計算的最低Tm低5℃，但是要根據(jù)經驗為不同條件下的PCR選擇不同的黏合溫度。內部的具有自身互補性的發(fā)卡結構不超過4個，其二聚體中不超過8個。3‘末端尤其重要，必須不含有與其他引物互補的序列，并且要與模板完全互補。倒數(shù)第二個最好是G/CPCR的各種變體反向PCR(InversePCR,IPCR)不對稱PCR(asymmetricPCR)多重PCR熒光定量PCR（Q-PCR)反轉錄PCR(reversetranscription,RT-PCR)

巢式PCR(NESTPCR)遞減PCR(TouchdownPCR)2023/2/410原理：擴增引物相反方向DNA

序列的技術。用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切酶對該段DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進行分析研究.

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已知序列未知序列反向PCR(InversePCR,IPCR)1.用一種在靶序列上沒有切點的限制性內切酶消化大分子量的DNA

2.產生的大小不同的線性DNA片段群體，其中具靶DNA區(qū)段的DNA分子長度不超過2-3Kb,經連接后環(huán)化成環(huán)狀分子3.按靶序列設計的一對向外引物同靶序列5，--端互補序列退火結合，其延伸方向如圖中箭頭所指4.經PCR擴增產生的主要是線性雙鏈DNA分子，它是由左側的序列和右側序列首位連接而成，其接點就是限制酶的識別位點2023/2/412應用：

利用反向PCR可對未知序列擴增后進行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆，建立全長的DNA探針。

應用于染色體步移、轉位因子和已知序列DNA旁側病毒整合位點分析等研究。局限性：

需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。2023/2/413

就像任何DNA一樣，PCR的雙鏈DNA產物也可以供序列測定使用。然而，按照Sanger雙脫氧末端鏈終止法測定DNA的核苷酸序列，最好是使用單鏈模版DNA?，F(xiàn)在已經發(fā)展出了一種專門用于制備單鏈DNA的技術—不對稱PCR技術。

這種技術，除了使用的兩種引物濃度相差100倍以外，其他的方面跟常規(guī)PCR技術沒有什么本質的區(qū)別。

不對稱PCR

2023/2/414基本原理：

PCR擴增所用的兩條引物中，濃度受限制的只及高濃度的1%（或2%）。經過PCR循環(huán)直到限制引物耗盡之前，擴增的引物是雙鏈的DNA序列。而后，反應混合物中的另一種高濃度的引物，則利用限制引物合成的DNA鏈做模板，繼續(xù)引導DNA合成。這樣模板鏈繼續(xù)再循環(huán)，由高濃度的引物合成的DNA要比限制引物多得多，而且仍保持單鏈狀態(tài)。2023/2/415不對稱PCR的原理多重PCR

一般PCR僅應用一對引物，通過PCR擴增產生一個核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定.多重PCR(multiplexPCR)，又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同

多重PCR的試驗步驟

同一般的PCR操作相同，只是反應中所加入的是多對引物而不是一對引物。

1.DNA提?。篋NA提取可以用DNA提取試劑盒或實驗室常用的一些DNA提取方法進行。

2.DNA定量：用紫外分光光度計進行DNA含量測定。

3.多重PCR擴增：反應體系可以選定為20μl，50μl等，反應體系中含有：DNA模板，Mg++，dNTP，TaqDNA聚合酶，各種引物等。根據(jù)實驗要求，設計合適的循環(huán)參數(shù)。在設計循環(huán)參數(shù)時要注意兩個原則：一是退火溫度要足夠高。這是因為，多重PCR技術是在擴增體系中加入了多對引物同時進行擴增，這樣就會由于錯配而產生一些非特異性的擴增產物，增高退火溫度，可以有效的減少非特異性擴增產物的生成；二是循環(huán)參數(shù)要盡量少，以利于檢測擴增產物。多重PCR在一個反應體系中同時擴增多個DNA段，其擴增效率并不是完全相同的，循環(huán)參數(shù)的增加，會使Taq酶的消耗增加，再加上每對引物相對退火效率不同，就會使擴增產物混亂，所以，循環(huán)次數(shù)不宜過多。

4.電泳檢測及結果分析：取擴增產物10×與26×載樣緩沖液(溴酚藍)混勻上樣，同時加入分子量標準，經2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mlE、恒壓(200-600V)、電泳1-2小時后，置凝膠于紫外檢測凝膠分析儀觀察結果，并拍照，記錄分析結果。

多重PCR的主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定和病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。1）多種病原微生物的同時檢測或鑒定，是在同一PCR反應管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行PCR擴增.

2）某些病原微生物，某些遺傳病或癌基因，型別較多，或突變或缺失存在多個好發(fā)部位，多重PCR可提高其檢出率并同時鑒定其型別及突變等可系統(tǒng)應用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳頭瘤病毒的分型;單純皰疹病毒的分型;杜氏肌營養(yǎng)不良癥的分型及癌基因的檢測等.

應用熒光定量PCR(Q-PCR)

Q-PCR：是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化,通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析

將模板稀釋成一系列的濃度梯度進行PCR反應，用個這個結果作標準曲線，模板可以用已知濃度的樣品或未知濃度的樣品。用模版初始量的log值對每個稀釋樣品的Ct值作圖，兩者稱遞減的線性關系，稱之為標準曲線。作標準曲線用來評定反應條件的優(yōu)化（保證樣本有準確可重復的實驗結果）

Q-PCR

熒光化學方法1）DNA結合燃料（SYBRGreen1）SYBRGreen1是熒光定量PCR最常用的DNA結合燃料，與dsDNA非特異性結合。在游離的狀態(tài)下，SYBRGreen1發(fā)出微弱的熒光，但一旦與dsDNA結合，熒光強度增加1000倍。

缺乏特異性；不能用于多重反應，因為不能區(qū)分不同擴增子發(fā)出的熒光，用于單重實驗。2）熒光燃料標記的序列特異性寡核苷酸引物或探針（TaqMan和分子信標）TaqMan實驗主要優(yōu)點：高特異性、高信噪比和能進行多重反應。

缺點：探針的初始成本比較高和實驗設計比較繁瑣。

熒光報告基團的種類：FAM(發(fā)綠色熒光)、HEX、TAMRA、Texas

Red和Cy5等

分子信標（molecularbeacon）是一種呈發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近。Q-PCR的應用（1）熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析，絕對定量和相對定量。生物學家通常對下列事情感興趣：a)給定的血樣中的病毒顆粒數(shù)；b)相當量的腫瘤組織和正常組織比，p53mRNA改變了多少倍。（2）基因表達差異分析。

例如：與一個生物合成途徑有關的三個基因（A、B、C），選擇內參基因為β-actin，在兩個樣本（a、b）中的相對表達情況。用TaqMan探針進行多重實驗擴增分析基因表達差異（3）基因型/等位基因分析，例如SNP檢測等（4）轉基因生物檢測，比如可以準確的檢測食品中某一種轉基因成分的含量。其實就是跟野生型生物相比該基因表達量RT-PCR

RT-PCR有很高的敏感性，可以用來分析不同組織，或是相同組織不同發(fā)育階段中mRNA表達狀況的相關性。2023/2/424巢式PCR

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內部）結合在第一次PCR產物內部，使得第二次PCR擴增片斷短于第一次擴增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異。一般應用于動物方面。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等巢式PCR，可以在106基因組背景下檢測到一個拷貝的病毒基因，所以特異性很好，但也是最容易污染的PCR。TouchdownPCR用來避免非特異性序列的擴增PCR中引物的黏合溫度(annealingtemperature)決定了黏合的特異性，溫度越高特異性越強，但過高則不能實現(xiàn)引物和模板的結合，而過低會產生大量非特異性產物。因此進行PCR時需要尋找合適的黏合溫度。遞減PCR開始先設定一個比較高的黏合溫度，每個循環(huán)黏合溫度下降1℃，到一個較低溫度以后每個循環(huán)的黏合溫度保持不變直到結束。在剛下降到特異性結合可以進行的最高溫度時，可以達到最高的特異性。這樣在起初的幾個循環(huán)中，特異性擴增序列可