細(xì)胞生物學(xué)設(shè)計(jì)型

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞生物學(xué)設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)演講人：李2014年12月2日目錄實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果融合率的計(jì)算實(shí)驗(yàn)試劑及材料注意事項(xiàng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈩?dòng)物細(xì)胞的融合熟悉PEG誘導(dǎo)細(xì)胞的方法掌握動(dòng)物細(xì)胞融合的基本原理及方法培養(yǎng)學(xué)生自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的能力二、實(shí)驗(yàn)原理一、動(dòng)物細(xì)胞融合1、概念：細(xì)胞融合：又稱細(xì)胞雜交，由兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞相互接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程稱為細(xì)胞融合。分為細(xì)胞自發(fā)融合和誘導(dǎo)細(xì)胞融合。誘導(dǎo)細(xì)胞融合：指在人為誘導(dǎo)條件下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象自發(fā)細(xì)胞融合：指在未施加任何條件的情況下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象。人工合成形成的融合細(xì)胞有兩類同核體異核體由同一親本細(xì)胞融合而來有不同親本細(xì)胞融合而來2、動(dòng)物細(xì)胞融合的基本原理與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相同，即細(xì)胞膜的流動(dòng)性3、誘導(dǎo)方式物理法：電激、振動(dòng)、離心化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）生物法:滅活病毒（如：仙臺(tái)病毒）4、動(dòng)物細(xì)胞融合的意義打破生殖隔離，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能；廣泛應(yīng)用于多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域；重要途徑：制備單克隆抗體。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）、50%PEG液的制備：取一定量的得PEG（MV=4000）放入刻度離心管內(nèi)，在酒精燈上加熱，使其融化，冷卻至50℃時(shí)，加入等體積的Hanks液混勻，置之37℃水浴箱中保溫待用。（二）、融合方法：取肝素抗凝的棄血清雞血0.1ml（本實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行同種細(xì)胞融合）。將懸液移入離心管中，以800r/min離心7~8min，棄上清液，加入8~10mlHanks液，再次懸浮細(xì)胞，離心洗滌二次，棄去上清液后將離心管倒置在濾紙上，盡量流盡剩余液體（這一步很重要，因?yàn)闅堄嘁后w會(huì)改變PEG的濃度）。用手指輕彈離心管底壁，使沉淀物松散，然后吸取制備好的50%PEG4ml，在37℃水浴中，于90s內(nèi)逐滴加入離心管中，邊加邊震蕩離心管，使之與細(xì)胞混勻，然后加入8~10Hanks液，輕輕吸打混勻，在37℃水浴中靜置5min以稀釋PEG。離心棄去上清液后，加2~3mlHanks液，在37℃水浴中溫育30min。實(shí)驗(yàn)操作流程（一）50%PEG液的制備取一定量PEG放入刻度離心管內(nèi)在酒精燈上加熱使其融化待降至50℃時(shí)加入等體積預(yù)熱的等體積Hanks液混勻置于37℃水浴箱中保溫待用（二）、融合方法取肝素抗凝雞血0.1ml制細(xì)胞懸液離心管中800r/min離心7~8min傾去上清液加入8~10mlHanks將懸液移入傾去上清液，將離心管倒置于濾紙上離心管用手輕彈吸取50%PEG0.4ml再次懸浮細(xì)胞離心洗滌二次在37℃水浴中加入7~8mlHanks于90s內(nèi)逐滴入離心管在水浴中靜置5min稀釋PEG棄去上清液在37℃水浴中溫育3min在5min10min15min20min30min取懸液制片用0.2%甲基藍(lán)染色觀察加2~3mlHanks四、預(yù)期結(jié)果融合過程觀察：分別于溫育5min10min15min20min30min取細(xì)胞懸液一滴制成臨時(shí)裝片，以0.2%次甲基藍(lán)染液染色，在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合的不同階段，通常可把融合過程大致分為五個(gè)階段。兩個(gè)細(xì)胞的膜相互接觸，粘連。相接的兩細(xì)胞膜破口粘合形成細(xì)胞膜通道。兩細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)相遇，形成細(xì)胞質(zhì)通道。通道擴(kuò)大，兩細(xì)胞連成一體。細(xì)胞合并完成，形成一個(gè)含有兩個(gè)或多個(gè)核的圓形細(xì)胞。五、融合率的計(jì)算融合率：是指在顯微鏡視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細(xì)胞，其細(xì)胞核的總數(shù)與視野內(nèi)所有細(xì)胞（包括已融合和未融合細(xì)胞）的細(xì)胞核總數(shù)之比。

對(duì)孵育30min時(shí)制備的臨時(shí)裝片計(jì)算融合率，通常以百分?jǐn)?shù)表示，進(jìn)行多個(gè)視野測(cè)定值得平均統(tǒng)計(jì)更加準(zhǔn)確。

融合率=（融合的細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)）*100%六、實(shí)驗(yàn)試劑及材料1、材料：雞紅細(xì)胞2、試劑：聚乙二醇（PEG，MV=4000）、Hanks液、0.2%次甲基藍(lán)染液。3、儀器設(shè)備：顯微鏡、水浴箱、離心機(jī)、離心管、載玻片、蓋玻片、酒精燈、試管、吸管，天平、濾紙。實(shí)驗(yàn)試劑表名稱規(guī)格用量說明聚乙二醇0.5ml使細(xì)胞膜重排Hanks液10ml洗滌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞0.2%甲基藍(lán)染色液適量染色實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備、器具表名稱規(guī)格、型號(hào)數(shù)量說明顯微鏡1觀察細(xì)胞融合水浴箱1加熱有利細(xì)胞融合離心機(jī)1使細(xì)胞分離離心管2裝離心液載玻片5制作裝片蓋玻片5制作裝片吸管4吸收細(xì)胞液試管3裝液酒精燈1加熱PEG天平1配平濾紙1吸水七、注意事項(xiàng)制備的50%PEG一定要保存于37℃水浴中，