核酸分子雜交及芯片技術(shù)

臨床分子診斷學(xué)-技術(shù)篇7核酸分子雜交及芯片技術(shù)NucleicAcidHybridizationandDNAChipTechnology教學(xué)內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理核酸探針核酸分子雜交技術(shù)方法DNA芯片技術(shù)1、變性（denaturation）

在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)，形成無(wú)規(guī)則線團(tuán)，雙鏈解鏈成為單鏈。無(wú)共價(jià)鍵斷裂。2、融解溫度（Tm值）：

在DNA熱變性時(shí)，其A260的升高達(dá)最大值一半時(shí)的溫度。影響Tm的因素：

（1）DNA堿基的組成

G-C含量越多Tm值越高

A-T含量越多Tm值越低（2）溶液的離子強(qiáng)度

低離子強(qiáng)度Tm值越低

高離子強(qiáng)度Tm值越高（3）pH值

pH值5-9Tm值變化不明顯

pH<4pH>11不利于氫鍵形成

（4）變性劑

干擾堿基堆積力和氫鍵的形成3、復(fù)性

變性DNA經(jīng)過(guò)一定處理通過(guò)堿基互補(bǔ)重新形成雙螺旋的過(guò)程。二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)通過(guò)隨機(jī)碰撞配對(duì)緩慢“拉鎖鏈”快

DNA濃度

DNA片段的大小

DNA片段復(fù)雜性

合適的復(fù)性溫度

適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度影響復(fù)性速度的因素:可逆性(非共價(jià)結(jié)合)序列特異性(堿基互補(bǔ)配對(duì))紫外吸收黏度沉降系數(shù)比旋度生物活性淬火退火掌握概念應(yīng)用：探針單鏈化核酸的變性與復(fù)性特點(diǎn)4、雜交

根據(jù)核酸變性和復(fù)性的原理，兩條來(lái)源不同，但具有互補(bǔ)序列的核酸，按堿基配對(duì)原則復(fù)性形成一個(gè)雜交體，這個(gè)過(guò)程即雜交，或稱(chēng)分子雜交。分類(lèi)

DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA高度特異的允許一定程度的錯(cuò)配嚴(yán)格度

教學(xué)內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理

核酸探針核酸分子雜交技術(shù)方法DNA芯片技術(shù)一、概念

探針（probe）

指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被特殊方法所檢測(cè)的分子。

例如抗原-抗體、生物素-親和素等均可看成是探針與靶分子的相互作用。

核酸探針

指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異互補(bǔ)雜交，雜交后又能被特殊方法檢測(cè)的已知被標(biāo)記（同位素或非同位素標(biāo)記）的核苷酸鏈。靶分子：核酸（DNAorRNA）核酸探針:1.與靶核酸分子特異互補(bǔ)的核苷酸鏈。2.被標(biāo)記，能被特殊方法檢測(cè)。實(shí)質(zhì)：通過(guò)檢測(cè)探針上的標(biāo)志物來(lái)反應(yīng)靶分子的存在與否以及量的多少。二、分類(lèi)

根據(jù)性質(zhì)和來(lái)源不同：

（1）基因組DNA探針

有內(nèi)含子，雜交效率低

（2）cDNA探針

無(wú)內(nèi)含子，適用于基因表達(dá)的檢測(cè)

（3）RNA探針

單鏈性，特異性高；不穩(wěn)定，易降解

（4）寡核苷酸探針

合成方便，靈敏度受長(zhǎng)度限制稍差二、分類(lèi)

根據(jù)標(biāo)記方法不同：

（1）放射性探針

（2）非放射性探針

理想的核酸探針標(biāo)記物應(yīng)具備

①高度的敏感性

②標(biāo)記物與探針結(jié)合后，不影響雜交時(shí)堿基配對(duì)及探針?lè)肿拥闹饕砘再|(zhì)；③檢測(cè)方法除有高靈敏性、高特異性、假陽(yáng)性率低外，尚需考慮環(huán)境污染少，價(jià)格低；

④若用酶標(biāo)記，應(yīng)對(duì)酶的Km值影響不大，以保證標(biāo)記反應(yīng)的效率和標(biāo)記產(chǎn)物的比活性。三、標(biāo)記（一）標(biāo)記物

放射性同位素標(biāo)記物

非放射同位素標(biāo)記物

1.放射性

常用的有32P/35S/3H。

特點(diǎn)：

檢測(cè)的靈敏度和特異性高

射線對(duì)人體有傷害

放射性物質(zhì)需特殊的處理

半衰期短不宜存放使用

2.非放射性標(biāo)記物

常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、熒光素、酶。

特點(diǎn)：

敏感性不如同位素標(biāo)記

穩(wěn)定性高、檢測(cè)時(shí)間短

操作簡(jiǎn)便

不需特殊的防護(hù)設(shè)備

不存在放射性污染（二）標(biāo)記法

酶反應(yīng)法

將標(biāo)記物（放射或非放射）預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，然后通過(guò)酶促反應(yīng)將標(biāo)記的核苷酸分子滲入探針?lè)肿又??；瘜W(xué)反應(yīng)法

利用標(biāo)記物(非放射為主)分子上的活性基團(tuán)與核酸分子上的基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而將標(biāo)記物結(jié)合到探針?lè)肿由稀?、隨機(jī)引物法（randompriming）

利用DNA聚合酶來(lái)合成與模板互補(bǔ)的新的DNA鏈。

將6-8寡核苷酸片段與已變性的DNA單鏈或RNA模板退火，使該片段隨機(jī)互補(bǔ)結(jié)合在單鏈分子上，在大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段作用下，以同位素標(biāo)記的dNTP為原料，寡核苷酸為引物的3’-OH端開(kāi)始沿5’至3’方向，合成一條與模板互補(bǔ)的新DNA鏈。隨機(jī)引物（6-8nt）：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。46=409648=65536DNA聚合酶ⅠKlenow片段：5’→3’DNA聚合酶活性弱3’→5’外切核酸酶活性無(wú)5’→3’外切核酸酶活性鏈替代，比活高隨機(jī)引物法（randompriming）

2、切口平移法

◆胰DNA酶I在DNA雙鏈上隨機(jī)切開(kāi)若干切口，切口處形成3’-OH末端。

◆大腸桿菌DNA聚合酶I以切口處開(kāi)始作用，以另一條DNA鏈為模板。

◆4種三磷酸脫氧核苷酸為原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修復(fù)加入標(biāo)記核苷酸同時(shí)進(jìn)行，切口平行推移。

生成的兩條鏈都被同位素均勻標(biāo)記。大腸桿菌DNA聚合酶I的活性種類(lèi)？5’3’聚合酶活性3’

5’外切酶活性5’3’

外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I

（1）5’3’聚合酶活性標(biāo)記（2）3’5’外切酶活性（3）5’3’外切酶活性切口平移

5’->3’外切酶活性使缺口平移5’->3’聚合酶活性上游鏈延伸而被標(biāo)記3.末端標(biāo)記法

末端標(biāo)記法是將標(biāo)記物導(dǎo)入線型DNA或RNA的5’端或3’端的一類(lèi)標(biāo)記法。

5’端標(biāo)記法

3’端標(biāo)記法（1）5’端標(biāo)記法（T4多聚核苷酸激酶）

用堿性磷酸酶切除DNA雙鏈分子或RNA單鏈5’末端的磷酸基團(tuán)，使其成為5’-OH，然后在（γ-32P）ATP存在下，經(jīng)T4多聚核苷酸激酶催化，將γ位上的32P轉(zhuǎn)移到DNA或RNA分子的5’-OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5’端均帶32P標(biāo)記。T4多聚核苷酸激酶催化（2）3’端標(biāo)記法（大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段）

大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段有5’→3’DNA聚合酶和微弱的3’→5’外切酶活性，但無(wú)5’→3’外切酶活性。對(duì)殘缺3’末端可進(jìn)行標(biāo)記。

末端的性質(zhì)？教學(xué)內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理

核酸探針

核酸分子雜交技術(shù)方法DNA芯片技術(shù)

核酸分子雜交↓

固相雜交液相雜交膜上印跡雜交核酸原位雜交核酸分子雜交的分類(lèi)核酸分子雜交技術(shù)是一種信號(hào)放大技術(shù)。一、膜上印跡雜交

印跡技術(shù)：將凝膠中待測(cè)的核酸分子轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的方法。指將待測(cè)核酸序列結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進(jìn)行雜交的過(guò)程。1．固相支持物的選擇常用的固相支持物：硝酸纖維膜（NC）尼龍膜

PVDF膜（聚二氟乙烯膜）2．印跡方法Methodsoftransfer虹吸印跡法（Capillary）真空轉(zhuǎn)移法（Vacuum）電轉(zhuǎn)移法（Electrophoretic）BlotDNAtomembrane

CapillaryBlotting(upward)

nospecialequipmentrequired!1975年E.SouthernSouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)DNA片段<1kb，1小時(shí)DNA片段>15kb，18小時(shí)Electrophoreticblotting不宜用硝酸纖維素膜一般2~3小時(shí)，最多6~8小時(shí)especiallygoodforsmallfragmentsresolvedbyPAGEVacuumblotting30~60分鐘moreefficientandquantitativethancapillarymustapplyvacuumevenlyandnottoostrongly3．印跡類(lèi)型

Southern印跡雜交

Northern印跡雜交斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交菌落或噬菌斑雜交原位雜交提取DNA限制性?xún)?nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤與DNA或RNA探針雜交放射自顯影Southernblottinghybridization預(yù)雜交Southern印跡雜交的應(yīng)用：

檢測(cè)靶分子為DNA,檢測(cè)靶分子是否含有目的基因。

可用于基因組基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切圖譜分析、基因突變分析、DNA指紋圖譜等。Northern印跡雜交

應(yīng)用DNA探針檢測(cè)特異mRNA的一種雜交技術(shù)，主要用于分析mRNA的轉(zhuǎn)錄或mRNA分子大小，其方法類(lèi)似于Southern印跡雜交。

RNA極易被RNase降解RNA酶抑制劑0.1%DEPC處理水(焦碳酸二乙酯)Northernblottinghybridization檢測(cè)靶分子為RNA，單鏈，探針制備時(shí)需注意是否與靶分子配對(duì)。pancreaskidneyskeletalliverlungplacentabrainheartmuscleGEFmRNANouthernblottinghybridization優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、迅速（直接點(diǎn)樣）；可在同一張膜上進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)；應(yīng)用：同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,可以得到半定量的結(jié)果；核酸粗提樣品的檢測(cè)效果也較好。Dotandslotblottinghybridization將變性后的DNA或RNA直接點(diǎn)樣于膜上檢測(cè)的是基因組DNA還是mRNA?Colonyorphagehybridization

從重組DNA文庫(kù)中篩選陽(yáng)性克隆核酸原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）用標(biāo)記的已知核酸序列為探針，與細(xì)胞涂片或組織切片中核酸進(jìn)行雜交檢測(cè)的方法。每張標(biāo)本所用雜交液較少，20~100μl，為了避免雜交液蒸發(fā)后造成雜交液濃縮，需使用密閉的濕盒。在組織或細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行DNA或RNA精確定位和定量。核酸原位雜交的基本步驟1.細(xì)胞或組織的固定：載玻片2.組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)3.探針的選擇和標(biāo)記4.雜交5.雜交結(jié)果檢測(cè)探針與分裂中期染色體DNA雜交，研究特定核酸序列在染色體中的精確定位；探針與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交，觀察該組織細(xì)胞中特定基因的表達(dá)水平；用特異性的細(xì)菌、病毒的核酸作為探針對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行雜交，確定有無(wú)該病原體的感染。應(yīng)用：FISH(熒光原位雜交)結(jié)果地高辛標(biāo)記的探針用抗地高辛-羅丹明顯示(紅色)生物素標(biāo)記的探針，用抗生物素蛋白-FITC顯示(綠色)1.熒光染色體原位雜交(FluorescenceinsituHybridization；FISH)基本原理是將DNA探針用熒光染料標(biāo)記，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體上，來(lái)檢測(cè)DNA序列在染色體上的定位。

2.比較基因組原位雜交(ComparativeGenomicHybridization；CGH)由原位雜交發(fā)展起的一些新技術(shù)自學(xué)雜交基本流程（一）核酸分子與固相介質(zhì)的結(jié)合1.噬菌體/克隆的轉(zhuǎn)移2.從凝膠上轉(zhuǎn)移DNA:毛細(xì)轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)移（二）核酸的固定：烘烤（80℃，2h）、紫外、堿（三）雜交：預(yù)雜交、雜交、洗脫（四）雜交信號(hào)的檢測(cè)：放射自顯影、非放射性雜化分子的檢測(cè)核酸分子的濃度和長(zhǎng)度：

50～300bp,0.1～0.5g2.溫度:Tm-25℃3.離子強(qiáng)度:Na+濃度約為1mol/L4.雜交液中的甲酰胺:50%甲酰胺,降低Tm5.核酸分子的復(fù)雜性6.非特異性雜交反應(yīng):封閉影響雜交的因素常用封閉物：①變性非特異DNA：鮭魚(yú)精子DNA， 小牛胸腺DNA②高分子化合物：Denhardt溶液 脫脂奶粉核酸雜交分類(lèi)表雜交方法適用范圍Southern印跡檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分開(kāi)的DNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上Northern印跡檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分開(kāi)的RNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交檢測(cè)未經(jīng)分離的、固定在膜上的DNA或RNA分子菌落或噬菌斑雜交檢測(cè)固定在膜上的、經(jīng)裂解后從細(xì)菌或噬菌體中釋放出的DNA分子原位雜交檢測(cè)細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子教學(xué)內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理

核酸探針

核酸分子雜交技術(shù)方法

DNA芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)采用類(lèi)似集成電路制作中的微加工技術(shù)，將生命科學(xué)研究中的若干不連續(xù)過(guò)程（如樣品制備、生化反應(yīng)、檢測(cè)和分析步驟）集成到一塊幾平方厘米的芯片上，使這些分散的過(guò)程連續(xù)化與微型化，實(shí)現(xiàn)對(duì)大量生物樣品中的各種數(shù)據(jù)的快速、自動(dòng)和并行處理和分析。芯片技術(shù)微陣列芯片