高效液相 色譜 基本原理

第二章化學(xué)品的分離主講：張中一青島大學(xué)-化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院(環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院)Telmail:Zhangzy@Part.2高效液相、氣相色譜2.3高效液相色譜法高效液相色譜：在液相色譜柱中，采用顆粒極細(xì)的高效固定相，采用高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，全部工作過(guò)程通過(guò)儀器控制完成。高效液相色譜法優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化。尤其適用于那些不宜用氣相色譜分析的難揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定性物質(zhì)、離子型物質(zhì)和生物大分子等。目前已知化合物中，80%的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析。

色譜圖檢測(cè)信號(hào)和時(shí)間的關(guān)系圖不同的色譜峰對(duì)應(yīng)相應(yīng)的組分可以得到相應(yīng)組分的保留時(shí)間和峰面積信息。保留時(shí)間–定性分析峰面積–定量分析色譜峰的相關(guān)基本術(shù)語(yǔ)保留值：保留時(shí)間(tR):試樣組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最高峰時(shí)多需要的時(shí)間。

死時(shí)間（to）:不被保留物質(zhì)從進(jìn)樣到出峰最大值的時(shí)間。

調(diào)整保留時(shí)間(tR′

)：tR′=tR-to容量因子κ′：等于（固定相中溶質(zhì)的量/移動(dòng)相中溶質(zhì)的量）相對(duì)保留值α：表示相鄰兩峰調(diào)整保留時(shí)間的比值。理論塔板數(shù)N：對(duì)于色譜峰柱效率的一種度量。分離度Rs：色譜柱總分離效率的指標(biāo)，代表了兩組峰的分離效果。峰高（PeakHeigh)：從峰最大值到峰底的距離峰面積（PeakArea)：峰與峰底之間的面積峰面積=半峰寬*出峰高度(A=h*W)Wh兩個(gè)相鄰峰的分離程度。以?xún)蓚€(gè)組份保留值之差與其平均半峰寬值的比來(lái)表示：當(dāng)R<1時(shí)，兩峰會(huì)有部分重疊當(dāng)R=1時(shí)，兩峰少有重疊（5％的重疊）當(dāng)R>1.5時(shí)，兩峰完全分離（分離程度為大于99.7%）分離度（Resolution)提高分離度的途徑1）增加N：增加柱長(zhǎng)，提高填充劑效能。N增加峰型變窄。2）增加α：改變固定相、流動(dòng)相極性或用梯度洗脫，延長(zhǎng)分離時(shí)間。3）改變?chǔ)省洌阂苿?dòng)相極性減小則κ′增加，流出時(shí)間增加，峰型變寬分離度提高。HPLC的儀器構(gòu)成高效液相色譜儀一般可分為4個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。①高壓輸液泵高壓輸液泵要求能提供連續(xù)無(wú)脈沖的液流。泵所供應(yīng)的恒定流量變動(dòng)不宜超過(guò)1%，流量范圍在0.1-10mL/min，泵壓一般在10-40MPa。商品泵主要包括：螺旋注射泵、氣動(dòng)放大泵、往復(fù)柱塞泵等。高效液相色譜柱是決定分離效率的核心部分。一般采用不銹鋼材料制成。色譜柱內(nèi)壁應(yīng)經(jīng)過(guò)精密加工，具有高的光滑度。兩端接頭采用不銹鋼或聚四氟乙烯密封圈。常用色譜柱的內(nèi)徑在2-6mm，長(zhǎng)度在10-50cm。色譜柱中緊密填充粒度為5-10微米的顆粒狀固定相。最常用柱子是C-18柱（ODS柱）②色譜柱高效液相色譜可分為分析型和制備型兩種。分析型色譜柱常用內(nèi)徑為1~6mm的管子，而制備柱則用較粗的管子，一般用內(nèi)徑為25mm的管子，有的可達(dá)60mm。柱子長(zhǎng)度從幾十厘米到幾米，一般為25cm到1m。③檢測(cè)系統(tǒng)高效液相色譜常用的商品檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、光散射檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器等。檢測(cè)器性能紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器應(yīng)用范圍測(cè)量參數(shù)線性范圍檢測(cè)限/g.ml-1能否用于梯度洗脫對(duì)流速的敏感性對(duì)溫度的敏感性選擇性吸光度2.410410-9能不敏感低通用性折射率10410-10不能不敏感敏感選擇性熒光強(qiáng)度10310-10能不敏感低選擇性電流10410-10不能敏感敏感紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器：是高效液相色譜中最廣泛應(yīng)用的檢測(cè)器，適用于那些能在紫外/可見(jiàn)區(qū)有吸收的物質(zhì)。傳統(tǒng)的紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器一般選擇在最大吸收波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的二極管陣列檢測(cè)器可以實(shí)時(shí)記錄各個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度，可以給出每個(gè)色譜峰的保留時(shí)間-吸光度-吸收波長(zhǎng)的三維譜圖。熒光檢測(cè)器：適用于檢測(cè)紫外光激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。其靈敏度比紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，可檢測(cè)出ng級(jí)痕量有機(jī)物。具有極高的靈敏度和良好的選擇性。示差折光檢測(cè)器：對(duì)一些紫外沒(méi)有吸收的樣品可以用示差折光檢測(cè)器，它是通過(guò)檢測(cè)溶液折光指數(shù)的變化來(lái)測(cè)定樣品濃度的。它是一種通用檢測(cè)器。但是其靈敏度比紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器低3個(gè)數(shù)量級(jí)，受溫度影響波動(dòng)大，不適用于梯度淋洗。流動(dòng)相的選擇1）正相色譜與反相色譜2）分離方式的選擇分子量大于2000以上的大分子和高分子可采用凝膠色譜；極性大的水溶性化合物，在水中可以解離的離子化合物可采用不同類(lèi)型的離子交換樹(shù)脂作為填料；在水中溶解但不電離的化合物，如糖類(lèi)、可以用反相色譜，以甲醇或乙腈-水為流動(dòng)相；醇水不溶的弱極性和非極性樣品主要用正相吸附色譜法，以全多孔硅膠或氰基鍵合硅膠為固定相。氣相色譜法基本原理氣相色譜法(gaschromatography，GC)是采用氣體作為流動(dòng)相的一種色譜法，具有高靈敏度、高選擇性、高效、快速分離的特點(diǎn)。在氣相色譜中，流動(dòng)相(稱(chēng)為載氣)不和組分分子相互作用，其功能僅僅是攜帶試樣。氣固色譜-固定相是具有多孔性及大表面積的吸附劑微粒。氣液色譜-固定相是載體表面涂一層高沸點(diǎn)有機(jī)化合物的液膜(稱(chēng)為固定液)。GC系統(tǒng)概論氣相色譜高效液相色譜只能分析約20%揮發(fā)性物質(zhì)幾乎可分析各種物質(zhì)不能分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)可分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)使用毛細(xì)管柱可得到很高的柱效色譜柱不能很長(zhǎng)，柱效相對(duì)較低有很靈敏的檢測(cè)器

(ECD)和較靈敏的通用型檢測(cè)器

(FID&TCD)無(wú)靈敏的通用型檢測(cè)器流動(dòng)相為氣體無(wú)毒，較易處理流動(dòng)相毒性、費(fèi)用較高運(yùn)行操作容易運(yùn)行操作比氣相難GC的基本原理進(jìn)樣時(shí)分離時(shí)洗脫時(shí)應(yīng)用領(lǐng)域基礎(chǔ)化學(xué)塑膠農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑添加劑石化工業(yè)原油分析模擬蒸餾油品分析天然氣分析汽油添加劑分析環(huán)境檢測(cè)空氣污染水污染固體廢棄物土壤分析食品分析食物飲料香精香料農(nóng)殘制藥/刑偵新藥開(kāi)發(fā)品質(zhì)管制有機(jī)溶劑殘留藥物濫用2.氣相色譜系統(tǒng)控制面板氣路控制壓力控制柱箱計(jì)算機(jī)色譜工作站檢測(cè)器進(jìn)樣口氣體鋼瓶1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化器；4-氣流調(diào)節(jié)閥；5-轉(zhuǎn)子流量計(jì)；6-氣化室；7-色譜柱；8-檢測(cè)器①氣路系統(tǒng)氣路系統(tǒng)是一個(gè)密閉的管路系統(tǒng)，載氣在其中穩(wěn)定連續(xù)地運(yùn)行，要控制好載氣的純度和載氣流速。它包括載氣源、凈化干燥器、減壓閥、穩(wěn)壓閥、穩(wěn)流閥、壓力表、流量計(jì)、各種管線等。常見(jiàn)的氣相色譜儀有單柱單氣路和雙柱雙氣路兩種類(lèi)型，當(dāng)前一般氣相色譜儀都是雙柱雙氣路的，這種氣路結(jié)構(gòu)的儀器既能用于恒溫分析，也適用于程序升溫分析。②進(jìn)樣系統(tǒng)由進(jìn)樣器和氣化室組成。氣化室的作用是將液體樣品瞬間氣化，但又不發(fā)生分解。要把氣體或液體樣品快速而定量地加到色譜柱上端。③分離系統(tǒng)(色譜柱)色譜柱是氣相色譜的心臟，樣品的分離就是在柱內(nèi)進(jìn)行的。色譜柱由柱管和其中的固定相組成。填充柱的內(nèi)徑約為2～6mm，長(zhǎng)約1—6m，用不銹鋼、銅、玻璃或聚四氟乙烯等材料制成，管內(nèi)裝填顆粒狀的固定相。色譜柱的外形有螺旋形和u型兩種，色譜柱被安裝在密閉隔熱的柱箱內(nèi)，以利于準(zhǔn)確控制柱溫。柱內(nèi)固定相是分離的關(guān)鍵。④檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)由檢測(cè)器及其控制裝置組成，其作用是將被色譜柱分開(kāi)的各個(gè)組分的濃度或質(zhì)量信號(hào)轉(zhuǎn)變成易于測(cè)量的電信號(hào)，并輸送給放大記錄系統(tǒng)。檢測(cè)器的溫度對(duì)靈敏度等有一定影響，故也應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格控制。檢測(cè)器是色譜儀中的一個(gè)關(guān)鍵部件。常用的檢測(cè)器有熱導(dǎo)池檢測(cè)器、氫火焰離子化檢測(cè)器、電子捕獲檢測(cè)器和火焰光度檢測(cè)器等類(lèi)型。⑤記錄系統(tǒng)該系統(tǒng)包括放大器、記錄儀或數(shù)據(jù)處理裝置等。由于檢測(cè)器產(chǎn)生的電信號(hào)十分微弱，所以必須用放大器放大，再由記錄儀記錄下代表各組分的色譜圖，供定性定量分析用。采用氣相色譜與微機(jī)聯(lián)機(jī)的儀器，操作人員可直接使用按色譜術(shù)語(yǔ)設(shè)計(jì)的鍵盤(pán)，來(lái)完成各種功能的色譜操作和數(shù)據(jù)的處理，并將結(jié)果直接打印出來(lái)，快速準(zhǔn)確。⑥溫度控制系統(tǒng)溫度是氣相色譜分析中的最重要最敏感的工作條件之一，要求對(duì)氣化室、檢測(cè)器和色譜柱分別進(jìn)行嚴(yán)格的溫度控制，控溫精度均為±0.1℃。儀器上有3套獨(dú)立的自動(dòng)溫度控制電路及其輔助設(shè)備，分別使氣化室、檢測(cè)器恒定在適當(dāng)溫度，使柱溫恒定或按程序升溫。溫度控制系統(tǒng)的主要元件有鉑電阻或熱電偶等熱敏元件，電子放大器、可控硅、電熱器等，柱箱中還有排風(fēng)扇。通常用溫度計(jì)和測(cè)溫毫伏計(jì)來(lái)顯示溫度的高低。氣體作用：1）載氣：作為色譜的流動(dòng)相2）檢測(cè)器的工作氣體。載氣：惰性：He,Ar,N2,H2.根據(jù)檢測(cè)器,價(jià)格及方便程度來(lái)決定采用壓力調(diào)節(jié)器以獲得恒定的儀器輸入壓力控制流量來(lái)得到恒定的流速氣體的類(lèi)型由檢測(cè)器決定.氣體要求色譜級(jí)的高純氣體99.999%

過(guò)濾系統(tǒng):

除氧.

活性炭除碳?xì)浠衔?。分子篩除水氣體的供應(yīng)和控制載氣推薦采用H2、He:分離度好對(duì)TCD靈敏度最高，而且可保護(hù)W絲注意安全問(wèn)題5.進(jìn)樣口作用：樣品進(jìn)樣和汽化.要求：精度和重現(xiàn)性根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇進(jìn)樣技術(shù)圖4-11旋轉(zhuǎn)式六通閥(a)取樣位置；(b)進(jìn)樣位置色譜柱色譜柱材料和結(jié)構(gòu)

填充柱-短(2-3米),管內(nèi)徑較粗.

毛細(xì)管柱-長(zhǎng)(>60米),內(nèi)徑較細(xì).

所有材料均要求化學(xué)及熱性質(zhì)穩(wěn)定.

熱穩(wěn)定性-分析時(shí)所使用的溫度不應(yīng)致使色譜柱材質(zhì)受到破壞

化學(xué)穩(wěn)定性-在一定溫度下，色譜柱材質(zhì)不受分析物的影響注意：用色譜級(jí)、干凈的材料。填充柱玻璃、特氟瓏及不銹鋼材質(zhì)(惰性).填充柱中填有固態(tài)載體，上面涂有液態(tài)固定相，用于氣液色譜（GLC）或直接填充多孔固體，用于氣固色譜（GSC）.填充柱尺寸固態(tài)載體是液態(tài)固定相附著的載體增加與樣品接觸的表面積。細(xì)小、均勻、多孔。大部分采用硅土.標(biāo)準(zhǔn)大小顆粒.直徑大小與目數(shù)的關(guān)系例如:80/100目表明所有的顆粒將通過(guò)80目篩但不通過(guò)100目篩.80目篩是指篩網(wǎng)每英寸有80根標(biāo)準(zhǔn)直徑的網(wǎng)線。7.檢測(cè)器通用型檢測(cè)器（UniversalDetector)熱導(dǎo)檢測(cè)器（TCD）氫火焰檢測(cè)器（FID）

選擇性檢測(cè)器電子捕獲（ECD）脈沖火焰光度檢測(cè)器（PFPD）氮磷檢測(cè)器（TSD)氣、液相色譜的定量分析色譜的定量分析色譜相當(dāng)重要的應(yīng)用決定組分質(zhì)量、濃度或物質(zhì)在樣品中占的百分比平均或標(biāo)準(zhǔn)偏差用來(lái)作分析精密度的表示定量結(jié)果的數(shù)種計(jì)算方式出峰高度分析(peakhigh)出峰面積分析(peakarea)外標(biāo)法(externalstandard)內(nèi)標(biāo)法(internalstandard)百分歸一法(normalizedpercent)出峰面積分析范例

校正因子校正因子是定量計(jì)算公式中的比例常數(shù)，其物理意義是單位面積所代表的被測(cè)組分的量?？捎孟率奖硎荆?/p>

Mi–I組分的量；fi–I組分的校正因子；Ai–I組分的峰面積定量分析的依據(jù)是被測(cè)組分的量與響應(yīng)信號(hào)成正比，但相同含量的物質(zhì)由于物理、化學(xué)性質(zhì)的差別，即使在同一檢測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào)也不同，直接用響應(yīng)信號(hào)定量，必然導(dǎo)致較大誤差。故引入校正因子。歸一化法將樣品中所有組份的含量之和定為100%。計(jì)算其中某一組份百分含量的定量方法：其中：xi－試樣中組份I的百分含量

fi－組份I的校正因子

Ai－組份I的峰面積或峰高外標(biāo)法（ExternalStandard)在相同分析條件下，比較標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與樣品的色譜峰面積或峰高1.用已知的標(biāo)準(zhǔn)品配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣，測(cè)量各種濃度的峰高或峰面積，繪制響應(yīng)信號(hào)與百分含量的關(guān)系曲線2.測(cè)量樣品的峰面積或峰高，在校正曲線上查出其對(duì)應(yīng)的百分含量。要求：進(jìn)樣量、色譜分析條件嚴(yán)格不變

外標(biāo)法利用一系列標(biāo)準(zhǔn)品建立校正曲線精確的標(biāo)準(zhǔn)品含量與進(jìn)樣量必須已知建立出峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度的關(guān)系圖校正曲