第二章 基因工程制藥

第二章基因工程制藥2.1

概述1982年第一個基因重組產(chǎn)品——人胰島素在美國問世，吸引和激勵科學(xué)家利用基因工程技術(shù)研制新產(chǎn)品。迄今，30余種基因工程藥物投入市場，產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)和社會效益。生物技術(shù)用于疾病的預(yù)防和疑難雜癥的治療已經(jīng)成為現(xiàn)實。2.1.1利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)內(nèi)源生理活性物質(zhì)糖尿?。阂葝u素侏儒癥：人生長激素其它內(nèi)源性生理活性物質(zhì)：激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)多肽、調(diào)節(jié)蛋白、酶類及凝血因子等來源困難技術(shù)尚未解決造價高

利用基因工程技術(shù)獲得上述活性物質(zhì)成為可能2.1.2

基因工程藥物種類免疫球蛋白：抗原和單克隆抗體細(xì)胞因子：干擾素、白細(xì)胞介素、集落刺激因子、表皮生長因子、凝血因子激素：胰島素、生長激素、心鈉素酶類：尿激酶、鏈激酶、葡激酶、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑、超氧化物歧化酶2.1.3

利用基因工程生產(chǎn)藥品優(yōu)點可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性物質(zhì)和多肽，為臨床使用提供有效的保證可提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，便于對其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究，擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍可生產(chǎn)更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)對內(nèi)源性生理活性物質(zhì)使用中出現(xiàn)的問題可以通過基因工程進(jìn)行改造可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選范圍2.1.4我國基因工程藥物研發(fā)現(xiàn)狀1997年生產(chǎn)得到α1b干擾素上游技術(shù)落后3－5年下游技術(shù)（工程菌大規(guī)模發(fā)酵技術(shù)、新型生物反應(yīng)器研制、高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)、分離純化的優(yōu)化控制、高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)、生物傳感器等）落后15年2.2基因工程藥物生產(chǎn)過程上游技術(shù)：目的基因分離、工程菌（細(xì)胞）構(gòu)建 在實驗室完成下游階段：工程菌（細(xì)胞）大規(guī)模培養(yǎng)直到產(chǎn)品分離純化和質(zhì)量控制等。2.3目的基因獲得反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄-PCR法化學(xué)合成法篩選新基因方法：編碼序列富集法、島嶼獲救PCR法、動物雜交法、功能克隆法、構(gòu)建cDNA文庫、差異顯示技術(shù)等對已發(fā)現(xiàn)基因改造基因修飾技術(shù)定點突變技術(shù)目的：提高基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，提高體內(nèi)半衰期、提高表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性、降低有效使用劑量或提高表達(dá)量、降低毒性和免疫原性2.4基因表達(dá)目的基因表達(dá)產(chǎn)量表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性產(chǎn)物生物學(xué)活性表達(dá)產(chǎn)物分離純化2.4.1宿主應(yīng)滿足條件具有高濃度、高產(chǎn)量、高產(chǎn)率能利用廉價原料不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)溫度和細(xì)胞形態(tài)容易進(jìn)行代謝調(diào)控容易進(jìn)行重組DNA技術(shù)產(chǎn)物容易提取純化2.4.2宿主分類原核細(xì)胞：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌真核細(xì)胞：酵母、絲狀真菌大腸桿菌優(yōu)點：研究較為深入缺點：不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取時需將細(xì)胞破碎，造成提取困難分泌能力不足，真核蛋白常形成包涵體，表達(dá)產(chǎn)物須經(jīng)變性復(fù)性才能恢復(fù)其生物學(xué)活性不存在翻譯后修飾，只能適用于表達(dá)糖基化等枯草芽孢桿菌優(yōu)點：分泌能力強(qiáng)，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中不形成包涵體缺點：不能對蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化修飾會產(chǎn)生很強(qiáng)的胞外蛋白酶，可對產(chǎn)物進(jìn)行不同程度的降解鏈霉菌優(yōu)點：非致病，使用安全分泌能力強(qiáng)，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中具有糖基化修飾能力變鉛青鏈霉菌限制修飾能力弱，可作為理想的受體菌已構(gòu)建一系列有效的載體下游培養(yǎng)工藝成熟酵母優(yōu)點：遺傳背景清楚世代時間短，繁殖迅速，可廉價的大規(guī)模培養(yǎng)，無毒性基因操作簡單可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到胞外，可簡化產(chǎn)物分離純化工藝能對產(chǎn)物進(jìn)行糖基化修飾能很好的表達(dá)在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)不良的真核基因絲狀真菌優(yōu)點：有很強(qiáng)的蛋白分泌能力能正確進(jìn)行翻譯后加工，包括肽的剪切和糖基化修飾，而且糖基化修飾與高等真核生物相似安全，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝當(dāng)前研究重點加強(qiáng)對宿主菌遺傳背景的研究建立合適的克隆載體和DNA導(dǎo)入方法研究清楚影響基因表達(dá)的各種因素及相互關(guān)系尋找新的適于不同外源基因表達(dá)的宿主菌2.4.3大腸桿菌表達(dá)載體的要求載體能獨立復(fù)制具有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記具有很強(qiáng)的啟動子，且能為大腸桿菌RNA聚合酶識別應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受調(diào)控，只有誘導(dǎo)時才能轉(zhuǎn)錄應(yīng)具有強(qiáng)的終止子，以便于轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其它無關(guān)基因所產(chǎn)生的mRNA應(yīng)具有翻譯起始信號，以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素外源基因劑量外源基因表達(dá)效率啟動子強(qiáng)弱核糖體結(jié)合位點的有效性SD序列和起始密碼子的間距密碼子組成外源產(chǎn)物的穩(wěn)定性細(xì)胞的代謝負(fù)荷工程菌的培養(yǎng)條件如何提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白利用大腸桿菌的信號肽或真核蛋白自身的信號肽，以確保真核基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞漿（外源蛋白不易為細(xì)菌酶類所降解）中采用位點特異性突變，改變真核蛋白質(zhì)中二硫鍵的位置，從而增加穩(wěn)定性采用蛋白酶缺陷型菌株，減弱表達(dá)產(chǎn)物的降解細(xì)胞代謝負(fù)荷外源基因表達(dá)產(chǎn)物為異己物質(zhì)，對宿主菌有毒性，甚至使宿主細(xì)胞死亡大量的外源基因表達(dá)產(chǎn)物能打破宿主細(xì)胞生長平衡，影響其它代謝過程，影響宿主細(xì)胞生長和代謝，而細(xì)胞代謝損傷又抑制外源產(chǎn)物合成如何減輕細(xì)胞代謝負(fù)荷措施1：細(xì)胞大量生長時抑制外源基因表達(dá)措施2：宿主細(xì)胞的生長與質(zhì)粒的復(fù)制分開措施3：表達(dá)產(chǎn)物形成不溶于水的包涵體可降低對宿主的毒性真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的形式融合蛋白優(yōu)點：蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)穩(wěn)定，不易被降解，易實現(xiàn)高效表達(dá)缺點：融合蛋白只能作為抗原，所以會影響蛋白的免疫原性，一般不能作為人體注射用藥非融合蛋白優(yōu)點：能較好的保持蛋白原有活性缺點：易被蛋白酶破壞，且非融合蛋白氨基端通常帶有甲硫氨酸，在體內(nèi)用藥易引起人體免疫反應(yīng)分泌表達(dá)蛋白優(yōu)點：蛋白質(zhì)在外周質(zhì)穩(wěn)定，無活性的蛋白分泌時則具有活性，不含甲硫氨酸不易為降解，易實現(xiàn)高效表達(dá)缺點：產(chǎn)量不高，信號肽不被切割或者不在特定位置切割2.4.4酵母體系中的基因表達(dá)載體載體復(fù)制序列：Yep、YRp、YCp、Yip克隆載體：要求同時具備在大腸桿菌和酵母中復(fù)制和增殖的能力表達(dá)載體：普通表達(dá)載體：能方便的引入外源基因表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物組成，特別是對其N端氨基酸增減并無嚴(yán)格要求精確表達(dá)載體：要求在啟動子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有限制性內(nèi)切核酸酶位點，以利于接入外源基因，并使他在表達(dá)和加工后N端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同影響目的基因在酵母中表達(dá)的因素外源基因劑量外源基因表達(dá)效率啟動子分泌信號效率終止序列的影響外源蛋白的糖基化宿主菌株的影響菌株生長能力強(qiáng)菌體內(nèi)源蛋白酶較弱菌株性能穩(wěn)定分泌能力強(qiáng)2.5基因工程菌生長代謝特點菌體生長是菌體各成分尤其是生物大分子合成的綜合表現(xiàn)，通常用比生長速率來表征。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同碳源、控制補料或稀釋速率來控制菌體生長。控制菌體生長對提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，減少代謝副產(chǎn)物積累，提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。大腸桿菌的蛋白與菌體量的比值是基本恒定的，而菌體的生長速度也反應(yīng)了蛋白質(zhì)的合成速度。通過改變培養(yǎng)條件，會影響菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，進(jìn)而影響生物大分子合成和菌體生長。菌體生長與能量關(guān)系菌體生長由呼吸控制，各種碳源通過有限的呼吸能力所能提供的最大能量決定了菌體在這種培養(yǎng)基中的最大比生長速率。當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝所提供的能量時，由于呼吸鏈或三羧酸循環(huán)的供能不足，使部分乙酰輔酶A通過轉(zhuǎn)化為乙酸來供能，菌體往往產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸。高濃度乙酸可明顯抑制菌體生長。乙酸的抑制作用與培養(yǎng)基pH有關(guān)，適當(dāng)提高pH可減少乙酸的抑制作用。分批培養(yǎng)選用不同碳源，補料培養(yǎng)通過控制補料速度，連續(xù)培養(yǎng)通過控制稀釋速率都能在一定程度上控制菌體生長，從而減少乙酸產(chǎn)生，減少其抑制作用，以實現(xiàn)工程菌的高密度培養(yǎng)和提高重組產(chǎn)物的表達(dá)水平。菌體生長和前體供應(yīng)關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加氨基酸能使菌體比生長速率提高和蛋白質(zhì)合成增加。菌體中的小分子前體和催化結(jié)構(gòu)是有限的，因而使生物大分子的合成處于亞飽和狀態(tài)，限制了菌體的比生長速率。基因表達(dá)在各個水平的競爭是各個基因不想競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)的結(jié)果。由于工程菌質(zhì)粒的復(fù)制和外源基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，將加劇上述成分的不足，因此工程菌生長速率往往低于宿主菌，特別是在誘導(dǎo)后，由于外源基因的大量表達(dá)，菌體比生長速率下降，甚至生長停止。質(zhì)粒對菌體生長的影響中等拷貝數(shù)質(zhì)粒（56copy）的工程菌，TCL的一些關(guān)鍵酶及與前體合成有關(guān)的酶的相對水平增加，這些酶的基因大多是受終產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)的，外源基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯引起菌體內(nèi)前體濃度的降低可能是誘導(dǎo)這些酶濃度增加的原因之一。含高拷貝數(shù)質(zhì)粒（240copy）的工程菌與宿主菌相比，宿主菌大量前體被利用，引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)”。嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)是當(dāng)氨酰tRNA不足時，核糖體在密碼子上停留并合成ppGpp的結(jié)果。ppGpp是一個重要的調(diào)控因子，其濃度增加會導(dǎo)致RNA聚合酶在模板上的移動產(chǎn)生停頓，RNA鏈延長速度減慢，從而使游離RNA聚合酶濃度降低，嚴(yán)謹(jǐn)控制的啟動子（如rrnA）轉(zhuǎn)錄減少。另一種觀點認(rèn)為，ppGpp通過干擾RNA聚合酶與PL啟動子的專一識別反應(yīng)，而不是通過影響RNA鏈的延伸過程來減少轉(zhuǎn)錄的。由于rRNA啟動子受“嚴(yán)謹(jǐn)控制”，當(dāng)菌體內(nèi)氨酰tRNA鏈的延伸不足引起“嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)”時，rRNA合成減少，這樣翻譯水平的前體不足通過ppGpp濃度變化來調(diào)節(jié)核糖體濃度。2.6基因工程菌的不穩(wěn)定性基因重組菌的穩(wěn)定性是高水平發(fā)酵生產(chǎn)的基本條件基因工程菌的穩(wěn)定性至少應(yīng)維持25代以上2.6.1質(zhì)粒的不穩(wěn)定性分裂不穩(wěn)定：是指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：DNA從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。產(chǎn)生分裂不穩(wěn)定因素含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率，質(zhì)粒丟失率與宿主菌、質(zhì)粒特性和培養(yǎng)條件有關(guān)；兩種菌比生長速率差異的大小，主要由于丟失質(zhì)粒的菌體在非選擇性培養(yǎng)基中一般具有生長優(yōu)勢。產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定因素質(zhì)粒自發(fā)缺失與質(zhì)粒中短的正向重復(fù)序列之間的同源重組有關(guān)，具有兩個啟動子的質(zhì)粒更容易發(fā)生缺失。在無同源的兩個位點間也會發(fā)生缺失。培養(yǎng)條件。質(zhì)粒不穩(wěn)定性分析方法將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，均勻涂布于不含抗性標(biāo)記抗生素的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10－12h，然后隨機(jī)挑選100個菌落接種到含抗性標(biāo)記抗生素的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10－12h，統(tǒng)計長出的菌落數(shù)。每個樣品應(yīng)取3次重復(fù)的結(jié)果，計算出比值，該比值反映了質(zhì)粒的穩(wěn)定性。提高質(zhì)粒穩(wěn)定性方法（一）選擇合適的宿主菌：宿主菌的比生長速率、基因組系統(tǒng)的特性、染色體上是否有質(zhì)粒與外源基因同源序列等都會影響質(zhì)粒穩(wěn)定性。選擇合適載體：1）含低拷貝數(shù)質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒的子代菌的頻率較大，可通過提高增加質(zhì)?？截悢?shù)提高穩(wěn)定性；2）含高拷貝數(shù)質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒的子代菌的頻率較低，但由于大量外源質(zhì)粒的存在使含質(zhì)粒菌的比生長速率明顯低于不含質(zhì)粒菌，因此再增加拷貝數(shù)，會增加含質(zhì)粒菌的生長負(fù)勢，對質(zhì)粒的不穩(wěn)定性不利；3）對同一工程菌，控制不同的比生長速率可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)。選擇壓力：1）抗生素選擇壓力對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無能為力；2）添加抗生素在大規(guī)模生產(chǎn)時可增加成本，且添加容易被水解的抗生素只能維持一定時間。分階段控制培養(yǎng)：在生長階段使外源基因處于阻遏狀態(tài)，避免由于基因表達(dá)造成質(zhì)粒不穩(wěn)定問題的發(fā)生，使質(zhì)粒穩(wěn)定的遺傳，在獲得需要的菌體密度后，再去阻遏或誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。提高質(zhì)粒穩(wěn)定性方法（二）控制培養(yǎng)條件：1）提高比生長速率（溫度、溶氧、pH、限制性營養(yǎng)物質(zhì)濃度及有害代謝產(chǎn)物濃度）有利于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。由于重組菌對環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的受體菌反應(yīng)慢，可通過改變培養(yǎng)條件改變兩種菌比生長速率，從而改善質(zhì)粒穩(wěn)定性。2）重組菌在復(fù)合培養(yǎng)基中穩(wěn)定性較高，且需要保持較高的溶氧，通過間歇供氧和改變稀釋率可提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。固定化：基因重組菌在固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的基因產(chǎn)物的產(chǎn)率都會有很大提高。2.7基因工程菌中試中試可以得到大量產(chǎn)品供臨床實驗，也可將中試所得數(shù)據(jù)供生產(chǎn)設(shè)計時參考。主要考慮問題：適合商品化生產(chǎn)的工程菌設(shè)計發(fā)酵反應(yīng)器選擇反應(yīng)過程發(fā)酵培養(yǎng)基組分維持生產(chǎn)工藝最佳化的方法工藝檢測方法工藝控制方法工藝自動化使用方法生物催化劑使用產(chǎn)物提取純化方法的選擇分離精制技術(shù)的選擇2.7.1工程菌選擇用一般基因重組技術(shù)獲得有高產(chǎn)潛力能以工業(yè)原料為培養(yǎng)基生產(chǎn)工藝能采用一般工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)驗?zāi)墚a(chǎn)生和分泌蛋白不致病、無毒性，能安全生產(chǎn)符合國家衛(wèi)生部門有關(guān)規(guī)定代謝能控制產(chǎn)品有特異性發(fā)酵液黏度小2.7.2反應(yīng)器（發(fā)酵罐）設(shè)計設(shè)計前要考慮問題：1）培養(yǎng)細(xì)胞特性；2）細(xì)胞生長率；3）發(fā)酵罐消毒方法；4）溫度、pH、溶氧、二氧化碳及代謝產(chǎn)物；5）后處理效果。設(shè)計中要考慮問題：1)根據(jù)實驗條件需要，能連續(xù)發(fā)酵，又能分批發(fā)酵，并附有加料管、取料管及測量儀表；2)易安裝、移動；3）儀表所得數(shù)據(jù)可靠；4）數(shù)據(jù)重復(fù)性好；5）可任意裝置附件，罐體為不銹鋼材料，罐體與各附配件均打光，避免殘渣積存。2.7.3發(fā)酵培養(yǎng)基組成提供化學(xué)元素，如碳、氮、氧、氫等提供特殊營養(yǎng)源，如氨基酸、維生素提供能源，如葡萄糖控制代謝，培養(yǎng)基中加入活性物質(zhì)或改變溫度、pH，誘導(dǎo)菌株改變生長速率或代謝途徑以增加產(chǎn)量2.7.4工藝最佳化與參數(shù)檢測控制工藝最佳化：最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果、最佳化速度、最低失敗率等綜合指標(biāo)。參數(shù)檢測控制：1）主要參數(shù)，如pH、溫度、溶氧、CO2；2）生物量：渾濁度、細(xì)胞組分、總氮量及菌絲干重；3）碳源：糖、有機(jī)酸、乙醇、淀粉、脂質(zhì)；4）產(chǎn)品。2.7.5計算機(jī)的應(yīng)用計算機(jī)記錄與控制全部生產(chǎn)過程的數(shù)據(jù)，使工藝最佳化，產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量不斷提高，原材料與能源消耗不斷下降，成本不斷降低。2.8重組工程菌的培養(yǎng)良好的發(fā)酵工藝對表達(dá)外源蛋白至關(guān)重要，直接影響到產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)成本，決定產(chǎn)品的市場競爭力。建立有利于純化的發(fā)酵工藝，以提高產(chǎn)品的純度，改善其性質(zhì)。2.8.1基因工程菌的培養(yǎng)方式1）分批培養(yǎng)2）補料分批培養(yǎng)3）連續(xù)培養(yǎng)4）透析培養(yǎng)5）固定化培養(yǎng)分批培養(yǎng)控制方法DO-Stat法：通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣速率來控制溶氧在20％，用固定或手動調(diào)節(jié)補料的流加速率。BalabncedDO-Stat法：通過控制溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速及糖的流加速率，使乙酸維持在低濃度，從而獲得高密度菌體及表達(dá)產(chǎn)物。控制菌體比生長速率方法：1）通過調(diào)節(jié)葡萄糖流加速率以控制溶氧在20％；2）通過攪拌轉(zhuǎn)速控制。2.8.2基因工程菌培養(yǎng)工藝工程菌培養(yǎng)與傳統(tǒng)發(fā)酵存在很大差異。傳統(tǒng)發(fā)酵工藝生產(chǎn)生物制品是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。培養(yǎng)基是提高工程菌生長速率，保持重組質(zhì)粒穩(wěn)定性，使外源基因能高效表達(dá)。使用不同碳源對菌體生長和外源基因表達(dá)有較大影響，如：1）葡萄糖（副產(chǎn)物多）和甘油（菌體得率高）為碳源比生長速率和呼吸強(qiáng)度相差不大，但葡萄糖對lac啟動子又抑制作用；2）甘露糖不產(chǎn)生乙酸，但比生長速率和呼吸強(qiáng)度??；3）乳糖對lac啟動子有利。接種量是指移入的種子液體積與培養(yǎng)液體積的比例，其大小影響發(fā)酵產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接種量?。壕w延遲期長，不利于外源基因表達(dá)。接種量大：利于對基質(zhì)的利用，可縮短延遲期，減少污染機(jī)會。但菌體生長快，代謝產(chǎn)物積累過多，反而會抑制菌體生長。溫度可影響外源基因復(fù)制（改變基因劑量）、轉(zhuǎn)錄（影響RNA聚合酶）、翻譯（影響mRNA穩(wěn)定性）或小分子調(diào)節(jié)分子合成。溫度敏感型質(zhì)粒，升溫后質(zhì)?？截悢?shù)處于失控狀態(tài)，對菌體生長不利。溫度還影響蛋白活性和包涵體形成。溶解氧溶解氧濃度對菌體生長和產(chǎn)物生成有很大影響。外源基因的高水平轉(zhuǎn)錄和翻譯，細(xì)胞需要大量的能量，以促進(jìn)細(xì)胞呼吸，提高對氧的需求。只有維持較高水平的溶解氧（≥40％）才能提高帶有質(zhì)粒重組菌的細(xì)胞生長，利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。誘導(dǎo)時機(jī)的影響應(yīng)根據(jù)不同菌株的不同特點，并結(jié)合培養(yǎng)方式確定最佳的誘導(dǎo)時機(jī)。誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響熱誘導(dǎo)程序?qū)μ岣咄庠吹鞍妆磉_(dá)量至關(guān)重要，細(xì)胞生長溫度突然升高10度以上，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生某些熱激蛋白以適應(yīng)變化的環(huán)境。pH在發(fā)酵過程中pH變化是由工程菌的代謝、培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件所決定。細(xì)胞自身對pH有一定的調(diào)節(jié)能力，但外界條件變化過于激烈，細(xì)胞失去自身調(diào)節(jié)能力，從而影響細(xì)胞生長。工程菌發(fā)酵最佳化工藝是指最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果和最低失敗率等綜合指標(biāo)。只有對菌種的生物特性和發(fā)酵工藝了如指掌，最佳工藝設(shè)計才最合理。2.8.3基因工程菌培養(yǎng)設(shè)備發(fā)酵罐：要防止工程菌丟失攜帶的質(zhì)粒，保持基因工程菌的遺傳特性。微生物發(fā)酵：初級和次級產(chǎn)物，細(xì)胞生長并非主要目標(biāo)?；蚬こ叹l(fā)酵：基因表達(dá)產(chǎn)物。因此，培養(yǎng)設(shè)備以及控制應(yīng)滿足獲得高濃度的受體細(xì)胞和高表達(dá)的基因產(chǎn)物。發(fā)酵罐發(fā)酵罐體攪拌器滅菌系統(tǒng)空氣無菌過濾裝置殘留氣體處理裝置參數(shù)測量與控制系統(tǒng)培養(yǎng)液配置連續(xù)操作裝置發(fā)酵罐要求要提供菌體生長的最適條件培養(yǎng)過程不得污染保證純菌培養(yǎng)培養(yǎng)及消毒過程不得游離出異物不能干擾細(xì)菌代謝活動理想發(fā)酵罐應(yīng)當(dāng)滿足如下要求：穩(wěn)定性要好，一般用不銹鋼制成，罐體表面光滑易清洗，滅菌時無死角。與罐體連接的閥門用膜式閥，不用球閥所有的連接接口均用密封圈封閉任何接口不能有泄漏要防止雜菌污染，空氣過濾系統(tǒng)要采用活性炭和玻璃纖維棉材料要避免工程菌株的自然界擴(kuò)散，培養(yǎng)液要經(jīng)過化學(xué)處理或熱處理后排放排氣口要用蒸汽滅菌或微孔濾器除菌軸封可采用磁力攪拌或雙端面密封2.9高密度發(fā)酵一般是指培養(yǎng)液中工程菌的菌體濃度在50gDCW/L以上，理論最高值可達(dá)200gDCW/L。高密度發(fā)酵可實現(xiàn)在單個菌體對目標(biāo)基因的表達(dá)水平基本不變的前提下，通過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實現(xiàn)總表達(dá)量的提高。高密度發(fā)酵優(yōu)點可提高發(fā)酵罐內(nèi)的菌體密度提高產(chǎn)物的細(xì)胞水平量相應(yīng)的減少生物反應(yīng)器體積提高單位體積設(shè)備的生產(chǎn)能力降低生物量的分離費用縮短生產(chǎn)周期目的：降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率2.9.1影響高密度發(fā)酵的因素細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)條件發(fā)酵過程中的培養(yǎng)溫度發(fā)酵液的pH溶氧濃度有害的代謝副產(chǎn)物補料方式發(fā)酵液流變學(xué)特性培養(yǎng)基碳氮比例偏?。簳?dǎo)致菌體生長旺盛，造成菌體提前衰老自溶碳氮比例偏大：菌體繁殖數(shù)量小，細(xì)菌代謝不平衡，不利于產(chǎn)物積累

要達(dá)到理想效果，需對基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的配比進(jìn)行優(yōu)化，以滿足細(xì)菌大量繁殖和外源蛋白表達(dá)的需要。溶氧濃度維持較高的溶氧水平不僅利于菌體生長，而且有利于外源蛋白的表達(dá)。提高溶氧的方法：采用空氣分離系統(tǒng)提高空氣中氧分壓；將具有提高氧傳質(zhì)能力的透明顫藻血紅蛋白基因克隆至菌體中；采用與小球藻混合培養(yǎng)，用藻細(xì)胞光合作用產(chǎn)生的氧氣直接供菌體吸收。pH是保持菌體最佳生長狀態(tài)的必要條件。必須及時調(diào)節(jié)pH使其處于適宜的范圍，避免pH激烈變化對菌體生長和蛋白表達(dá)產(chǎn)生負(fù)面影響。溫度是影響細(xì)菌生長和調(diào)控細(xì)胞代謝的重要因素。代謝副產(chǎn)物大腸桿菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一些有害的代謝物質(zhì)，如乙酸、二氧化碳等，進(jìn)而抑制菌體生長和蛋白表達(dá)。2.9.2實現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法發(fā)酵條件的改進(jìn)構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌發(fā)酵條件的改進(jìn)培養(yǎng)基選擇：菌體的迅速分裂增殖應(yīng)與生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)相適應(yīng)，因此應(yīng)選擇易被工程菌利用的營養(yǎng)物質(zhì)。高密度培養(yǎng)各組分的濃度也要比普通培養(yǎng)基高2－3倍，才能滿足高密度發(fā)酵中工程菌對營養(yǎng)物質(zhì)的需求。建立流加式培養(yǎng)方式提高供氧能力小結(jié)單獨考慮營養(yǎng)源、溶氧濃度、pH、溫度等是不夠的，需要對它們進(jìn)行綜合考慮。對發(fā)酵條件進(jìn)行全面優(yōu)化，才能盡可能提高菌體密度和基因產(chǎn)物的生成。構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑對碳代謝流進(jìn)行分流限制進(jìn)入糖酵解途徑的碳代謝流引入血紅蛋白基因2.10基因工程藥物的分離純化2.11變性蛋白的復(fù)性2.11.1