第二章 培養(yǎng)基

第一部分：細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基☆培養(yǎng)用液——水平衡鹽溶液消化液☆培養(yǎng)基——天然培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基

細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)第二部分內(nèi)容：原代細(xì)胞分離、培養(yǎng)（酶消化法和組織塊培養(yǎng)法）。細(xì)胞生長狀況的觀察。培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程。傳代。凍存與復(fù)蘇。細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)（如細(xì)胞污染）。細(xì)胞培養(yǎng)的一些專業(yè)術(shù)語介紹（如細(xì)胞株、系，上皮細(xì)胞型、成纖維細(xì)胞型）第一部分：

動(dòng)物細(xì)胞用液的制備細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基☆培養(yǎng)用液——水平衡鹽溶液消化液☆培養(yǎng)基——天然培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基

細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)配液前準(zhǔn)備：①濾器、濾膜、磁力攪拌器、天平、燒杯、量筒、注射器。貯液瓶（生理鹽水瓶）、瓶塞、15磅，121℃，20分鐘蒸氣滅菌②NaHCO3、NaOH、HCl、胎牛（小牛）血清、青霉素、鏈霉素、三蒸水、培養(yǎng)基粉劑配液過濾無菌操作要求：操作前無菌室及無菌操作臺(tái)以紫外燈照射30分鐘滅菌，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘操作時(shí)，小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口。在整個(gè)無菌操作過程中都應(yīng)該在酒精燈的周圍進(jìn)行一、細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)液——水●（一）水——營養(yǎng)物、代謝物溶于水中調(diào)節(jié)滲透壓、平衡pH值普通自來水含大量雜質(zhì)，不利于細(xì)胞生長高度純化水——離子交換水：蒸餾水：三蒸、新鮮超純凈水：離子交換水：離子交換水中仍有一些非離子物質(zhì)及有機(jī)物，一般在細(xì)胞培養(yǎng)中較少使用。雙蒸水、三蒸水：

細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水

超純凈水：采用進(jìn)口的RO膜、離子交換膜、離子交換樹脂、拋光核子級(jí)樹脂、靜音高壓泵、電磁閥等，產(chǎn)品性能得到最大化的保證；分子生物學(xué)、生命科學(xué)、基因研究、組織培養(yǎng)、試管嬰兒、生物工程、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、培養(yǎng)基制備、DNA測序、氨基酸分析、疾控中心、水質(zhì)檢測中心、藥檢所、質(zhì)檢所、高?？蒲械葮?biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室及各種高端精密儀器用水。（二）、平衡鹽液體（Balancedsaltsolution,BSS）

：組織細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體，可以維持滲透壓、調(diào)節(jié)pH值、供給細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分如：PBS、Hanks用途：用于洗滌組織、細(xì)胞或配制消化液時(shí)等平衡鹽液體：組成無機(jī)鹽、葡萄糖種類：氯化鈉濃度、離子濃度、緩沖系統(tǒng)不同Earle——NaHCO3含量高、緩沖能力高，5%CO2平衡Hanks——NaHCO3含量低、緩沖能力低，空氣平衡D-Hanks——不含鈣、鎂離子Dulbecco——含少量鈣、鎂離子PBS——磷酸緩沖系統(tǒng)

PBS（Phosphate-BufferedSallines）

KCl0.20gKH2PO40.20g

NaCl8.00g

Na2HPO4·7H2O2.16gDPBS（Dulbecco’sPhosphate-BufferedSallines）標(biāo)準(zhǔn)型CaCl2(anhyd.)(無水氯化鈣)0.10gKCl0.20gKH2PO40.20gMgCl2·6H2O0.10gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16gD-Hanks’平衡鹽溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNaCO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g

（三）、消化液——分散組織、細(xì)胞作用：（1）在進(jìn)行原代培養(yǎng)過程中需分散組織、細(xì)胞。（2）在傳代中要使細(xì)胞脫離附著的底物時(shí)均需使用消化液。類型：組織細(xì)胞培養(yǎng)中常用的消化液為胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二鈉（EDTA）及膠原酶溶液，可以分別單獨(dú)使用或混合使用?！袷辜?xì)胞間的蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞分散培養(yǎng)細(xì)胞傳代。分離組織、細(xì)胞團(tuán)消化所需時(shí)間和濃度與細(xì)胞特性相關(guān)特點(diǎn)：1、胰蛋白酶的活力用解離酪蛋白的能力來表示，常用的有1：125和1：250兩種。2、許多學(xué)者認(rèn)為鈣、鎂離子和血清的存在都會(huì)降低胰蛋白酶的活力。消化細(xì)胞時(shí)，加入一些血清（10%）或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用。胰蛋白酶液(Trypsin)稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks平衡鹽（或PBS）溶液調(diào)成糊狀，再補(bǔ)足D-Hanks平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4小時(shí)或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩次日，過濾除菌，分裝入瓶中，-20℃保存?zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐ВＳ脻舛葹?.25%（0.1%-0.5%）。如果短期內(nèi)要使用，就放置4℃冰箱。胰蛋白酶溶液配制：EDTA·4Na溶液：一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價(jià)格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。

注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會(huì)影響細(xì)胞生長（E-cadherin)EDTA溶液配制：用D-Hanks’平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4℃冰箱保存聯(lián)合使用：胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合使用可提高消化效率(細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附分子需要Ca2+:cadherin,selectin,integrin).但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要徹底清洗，否則細(xì)胞易脫壁。聯(lián)合使用：常用的配制方法（0.25%trypsin-0.04%EDTA溶液）：胰蛋白酶0.25g，EDTA0.04g，PBS(-)液100mL，燒杯內(nèi)磁力攪拌充分溶解，0.22μm濾膜正壓過濾，-20℃冰箱保存。消化細(xì)胞間質(zhì)，分離上皮細(xì)胞與膠原成分。根據(jù)細(xì)胞類型選用不同型號(hào)膠原酶（Ⅰ-Ⅳ）。

新鮮配制、37-38oC作用、時(shí)間控制。

EDTA不可與膠原酶聯(lián)用，因膠原酶的消化作用依賴于鈣。附：細(xì)胞外基質(zhì)成分有膠原、纖粘蛋白（FN）、層粘連蛋白（LN）、彈性蛋白等）膠原酶液

：（四）、pH調(diào)整液：NaHCO3溶液常用濃度為7.5%。配制時(shí)用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存（五）、HEPES溶液：一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對(duì)細(xì)胞無毒性主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES使用終濃度一般為10-50mmol/L（分子量238.31）溶液常配成1M儲(chǔ)存液：用20ml雙蒸水溶解4.76克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入2mlHEPES濃縮液，終濃度為20mmol/L（六）、谷氨酰胺補(bǔ)充液：谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加.配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時(shí)，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)使用終濃度為1-4mmol/L一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制方法為：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫30℃），過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mmol/L（七）、酚紅：大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH指示紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫色表示堿性pH七、酚紅：在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅因?yàn)橐延幸恍┭芯勘砻鳎悍蛹t能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用.（八）、抗生素溶液：抗生素使用種類與濃度：

工作濃度

儲(chǔ)存溫度

殺滅細(xì)菌

penicillin100u/ml-20℃G(+)

streptomycin100ug/ml-20℃G(+)、G(-)

gentamicin50ug/ml-20℃G(+)、G(-)、支原體

amphotericinB2.5ug/ml-20℃

真菌(二性霉素B）

nystatin50ug/ml-20℃真菌（制霉菌素）

抗生素溶液通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對(duì)革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。

培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位

抗菌素液（青、鏈霉素：）：青、鏈霉素：最終濃度為青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml。一般市售市售鏈霉素為100萬U/瓶，將其溶解在10mlHanks液或三蒸水中，取8ml鏈霉素液溶解80萬U/瓶青霉素，即成為青霉素、鏈霉素各1.0×105U/ml的母液.使用時(shí)每100ml培養(yǎng)液中加0.1ml，即成最終濃度為100U/ml。三、培養(yǎng)基培養(yǎng)基——維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液●天然培養(yǎng)基取自動(dòng)物營養(yǎng)成分豐富；來源受限血清：小牛、胎牛、馬、人（市售）須滅活補(bǔ)體（56oC、30min）、-20oC保存

質(zhì)量差異大（無細(xì)菌、支原體、病毒）血漿雞血漿；現(xiàn)少單獨(dú)使用合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基一般需加血清等成分氨基酸、維生素、糖類、無機(jī)離子、輔助成分

市場上可提供干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜。缺點(diǎn)是配制過程繁瑣，質(zhì)量不易控制液體培養(yǎng)基是由專業(yè)廠家按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)?；a(chǎn)，不僅質(zhì)量得到保證，而且使用十分方便●種類根據(jù)細(xì)胞特性選擇（文獻(xiàn)）

199——成分復(fù)雜，不常用；改良為109效果較199好

Eagle系列——MEM（Eagle最低必需培養(yǎng)液）

BMEM（氨基酸改良）

DMEM（增加成分）：高糖、低糖

RPMI1640——常用、懸浮細(xì)胞、多種細(xì)胞

Ham——F12：加微量元素等，可少用血清單細(xì)胞、克隆化培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇：選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考：(1）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時(shí)咨詢。(2)其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。(3)根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選RPMI1640。RPMI1640種類RPMI—1640（A）（不含谷氨酰胺、可高壓滅菌）RPMI—1640（A）無酚紅（不含谷氨酰胺、高壓滅菌）RPMI—1640

（含谷氨酰胺、除菌過濾滅菌）

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基

是在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的與MEM比較增加了各種成分用量，同時(shí)又分為高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長，適于生長較快、附著較困難腫瘤細(xì)胞等。

DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高壓滅菌】

DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌過濾滅菌】

DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌過濾滅菌】。

干粉培養(yǎng)基的配制

認(rèn)真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于4度。合成培養(yǎng)基的配制

：①濾器、濾膜、磁力攪拌器、天平、燒杯、量筒（容量瓶）、貯液瓶（生理鹽水瓶）、瓶塞、注射器。②NaHCO3、NaOH、HCl、胎牛（小牛）血清、青霉素、鏈霉素、三蒸水、培養(yǎng)粉步驟：①配制培養(yǎng)基需新制備的三蒸水，一般在配制當(dāng)天或前一天制備為最好，這樣可以保證水的純度和質(zhì)量。調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值的HCl和NaOH溶液也需用這種水配制。配制培養(yǎng)基的各種器皿都應(yīng)做到絕對(duì)干凈，烤干后使用（專用）。將干粉型培養(yǎng)基溶于總量1/3的水中，再用水洗包裝袋內(nèi)面兩次，倒入培養(yǎng)液中，以保證所有干粉都溶解成培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中加入磁性攪棒，把盛培養(yǎng)液的器皿放在磁力攪拌器上攪拌，補(bǔ)加水到最終量。培養(yǎng)液配制過程中一般不需加熱助溶。根據(jù)包裝袋上的要求和實(shí)驗(yàn)需要補(bǔ)加NaHCO3和谷氨酰胺。加抗生素：上述溶液配制好后，用過濾法消毒除菌，采用0.22μm和0.45μm濾膜各1張。分裝于玻璃瓶中，使用時(shí)再加血清。取樣培養(yǎng)2日以檢測污染（防止污染的處理：檢查過濾裝置3次。每次操作燒瓶口）使用加入牛血清、抗菌素

合成培養(yǎng)基一般在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)均需要加入血清。一、牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要功能：⒈提供激素、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中少有的營養(yǎng)成份、低分子營養(yǎng)物。⒉提供結(jié)合蛋白，識(shí)別維生素、脂類、金屬離子，調(diào)變結(jié)合物質(zhì)活力。⒊與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起解毒作用。⒋是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子的來源。⒌起酸堿度緩沖液作用。⒍提供蛋白酶抑制劑，使胰酶失活，保護(hù)細(xì)胞。

二、牛血清的主要成份⒈蛋白質(zhì)：攜帶金屬離子、脂肪酸和自身激素類蛋白、白蛋白、球蛋白纖維粘連素、α2巨球蛋白、胎球蛋白（胎牛血清）。⒉多肽：血小板促生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮細(xì)胞生長因子、神經(jīng)細(xì)胞生長因子等。⒊激素：胰島素和、類胰島素生長因子、促生長激素、氫化可的松。⒋其他成份：氨基酸、葡萄糖、酮酸、結(jié)合狀態(tài)的微量