第十二章 微生物與現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)

第十一章微生物與現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)

第一節(jié)概述發(fā)酵概念與發(fā)酵工程

1.Fermentation

原始概念:從液體中向外冒氣泡狹義概念:有機物脫下的氫直接交給另一內(nèi)源有機物的過程廣義概念：應(yīng)用微生物生產(chǎn)某種產(chǎn)品的過程好氧、厭氧過程2.天然發(fā)酵與純培養(yǎng)（pureculture）發(fā)酵多種微生物混合發(fā)酵：我國釀酒純培養(yǎng)發(fā)酵:提高了產(chǎn)品的穩(wěn)定性發(fā)酵工業(yè)的第一個轉(zhuǎn)折點3.通氣攪拌：發(fā)酵工業(yè)的第二個轉(zhuǎn)折點

青霉素，通氣攪拌液體發(fā)酵技術(shù)現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)最主要的生產(chǎn)方式利用需氧菌進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)4.代謝控制發(fā)酵技術(shù)：發(fā)酵工業(yè)的第三個轉(zhuǎn)折點

生化、微生物、遺傳學(xué)的深入發(fā)展

1956年，缺陷型菌株進行氨基酸發(fā)酵積累預(yù)期的氨基酸5.基因工程菌株進行發(fā)酵--“借雞下蛋”發(fā)酵工業(yè)的第四個轉(zhuǎn)折點有目的控制發(fā)酵產(chǎn)物：胰島素、干擾素等6.發(fā)酵工程：實現(xiàn)最終目標的途徑發(fā)酵工藝學(xué)和工程學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物菌種的選育最佳發(fā)酵條件的選定和控制生化反應(yīng)器的設(shè)計發(fā)酵產(chǎn)品的分離和精致等

二.發(fā)酵工業(yè)范圍

1.以微生物細胞為產(chǎn)物

SCP(SingleCellProtein)，某些疫苗等

2.微生物的代謝產(chǎn)物初級、次生代謝產(chǎn)物氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、核酸、脂類及碳水化合物、抗生素等

3.微生物酶

4.生物轉(zhuǎn)化，如甾體轉(zhuǎn)化等

5.處理廢物三.發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分1.醫(yī)藥工業(yè)抗生素、維生素、胰島素、乙肝疫苗、干擾素、透明質(zhì)酸等2.食品工業(yè)微生物蛋白、氨基酸、新糖原、飲料、酒類、食品添加劑(檸檬酸、乳酸、天然色素等)3.能源工業(yè)酒精發(fā)酵、沼氣發(fā)酵等

4.化學(xué)工業(yè)化工原料如乙醇、丙酮、丁醇等生物表面活性劑生物絮凝劑

5.冶金工業(yè)用于黃金開采和銅、鈾等金屬的侵提

6.農(nóng)、牧業(yè)生物固氮、生物殺蟲劑和微生物飼料的生產(chǎn)

7.環(huán)境保護污染物降解與轉(zhuǎn)化

四.發(fā)酵方式（類型）按微生物培養(yǎng)工藝固體發(fā)酵液體發(fā)酵

斜面菌種培養(yǎng)菌體或孢子懸液制備種子擴大培養(yǎng)發(fā)酵發(fā)酵液處理提取與精致成品檢驗包裝出廠

典型發(fā)酵過程示意圖（一）固體發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵原料：固體形式微生物：將原料轉(zhuǎn)化為發(fā)酵產(chǎn)品淺層發(fā)酵、轉(zhuǎn)桶發(fā)酵、厚層通氣發(fā)酵優(yōu)點：設(shè)備、方法簡單，能耗低，原料粗放缺點：占地面積大、原料利用率低、產(chǎn)物復(fù)雜、一般為天然發(fā)酵釀酒、醬油、食醋等采用這種發(fā)酵方式

固體發(fā)酵圖（二）液體發(fā)酵生產(chǎn)微生物將液體培養(yǎng)基中的原料轉(zhuǎn)化為發(fā)酵產(chǎn)品表面發(fā)酵深層液體發(fā)酵：現(xiàn)代發(fā)酵的主要方式菌體或菌絲均勻分散在液體培養(yǎng)基中通過向培養(yǎng)液強制通氣進行發(fā)酵

抗生素、氨基酸、酶制劑等

酒精、丙酮、丁醇等采用厭氧深層發(fā)酵

我國工業(yè)生產(chǎn)味精使用的菌種主要是經(jīng)過誘變育種得到的營養(yǎng)缺陷型的北京谷氨酸棒狀桿菌

啤酒制造工藝流程啤酒制造工藝流程

液體發(fā)酵發(fā)酵優(yōu)點：規(guī)模大、發(fā)酵速度快、生產(chǎn)效率高容易實現(xiàn)自動化控制

1.分批發(fā)酵在一個密閉的系統(tǒng)內(nèi)一次性投入培養(yǎng)基的發(fā)酵方法2.連續(xù)發(fā)酵新鮮培養(yǎng)基連續(xù)加入發(fā)酵罐發(fā)酵液不斷從罐內(nèi)放出發(fā)酵罐內(nèi)液量維持恒定優(yōu)點：設(shè)備利用率高，便于自動化控制缺點：菌株易變異，易被雜菌污染

分批發(fā)酵示意圖

連續(xù)發(fā)酵示意圖

3.補料分批發(fā)酵：加料：間歇地或連續(xù)放料：一次性有控制地進行分批發(fā)酵

4.計算機控制的發(fā)酵應(yīng)用傳感器隨時獲得發(fā)酵罐內(nèi)各參數(shù)的變化對發(fā)酵進行自動控制

（三）發(fā)酵的逐級放大

1.小試實驗室小型設(shè)備，三角瓶、1~50L發(fā)酵罐對培養(yǎng)基的成分、配比、pH、培養(yǎng)溫度通氣量等進行大量實驗得出小試最佳條件初步評價發(fā)酵效益和生產(chǎn)的可能性

2.中試試驗工廠或車間的小規(guī)模設(shè)備

199-5000L發(fā)酵罐相應(yīng)的分離、過濾、提取、精制等設(shè)備小試的進一步放大基本確定發(fā)酵產(chǎn)物大規(guī)模生產(chǎn)可能性3.大試實驗性生產(chǎn)，或工程性實驗研究大型發(fā)酵罐等設(shè)備是發(fā)酵工業(yè)新產(chǎn)品或改良產(chǎn)品或工藝改造的必由之路（四）發(fā)酵生產(chǎn)中的培養(yǎng)基類型

1.斜面培養(yǎng)基供給細胞生長繁殖所需要的各類營養(yǎng)物質(zhì)富含有機氮源，少量糖分有機氮有利于菌體生長繁殖，獲得更多細胞放線菌、霉菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)基：氮源和碳源太多容易長菌絲，而不易形成孢子

2.種子培養(yǎng)基（搖瓶和小發(fā)酵罐）培養(yǎng)出很多健壯和活性高的細胞豐富培養(yǎng)基(氮源、生長因子）培養(yǎng)時間短，不要求積累大量產(chǎn)物營養(yǎng)物質(zhì)濃度不要太高供孢子發(fā)芽用培養(yǎng)基要補充容易被吸收利用碳源和氮源基本與發(fā)酵培養(yǎng)基一致（適應(yīng)時間，誘導(dǎo)酶）3.發(fā)酵培養(yǎng)基：主要目的是為了獲得預(yù)期產(chǎn)物營養(yǎng)成分細胞生長產(chǎn)物形成

（五）下游加工過程從發(fā)酵液中分離、精制有關(guān)產(chǎn)品的過程

發(fā)酵液（混合物）：細胞、代謝產(chǎn)物、剩余培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)品在混合物中含量較低發(fā)酵產(chǎn)品一般都具有生物活性

下游加工的工藝流程

1.發(fā)酵液預(yù)處理和固液分離

1）預(yù)處理：改善發(fā)酵液性質(zhì)，有利于固液分離酸化、加熱、加絮凝劑等

2）固液分離常用過濾、離心等方法

3）胞內(nèi)產(chǎn)物還需破碎細胞實驗室方法工業(yè)生產(chǎn)方法：高壓勻漿器和球磨機用離心、兩水相萃取等方法分離細胞碎片

2.提取活性物質(zhì)濃度較低

1）吸附法抗生素等小分子物質(zhì)可用大網(wǎng)格聚合物、活性炭、白土、氧化鋁、樹脂等吸附劑吸附

2）離子交換法極性化合物可用此法

3）沉淀法（蛋白質(zhì)的提取和濃縮）鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀非離子型聚合物沉淀等

4）萃取法溶劑萃取、兩水相萃取、超臨界流體萃取

5）超濾法超濾膜進行溶質(zhì)的分離或濃縮大小分子分離、脫鹽等

3.精制（純度）結(jié)晶：小分子物質(zhì)層析：大分子物質(zhì)凝膠層析離子交換層析聚焦層析疏水層析親和層析

4.成品包裝濃縮、無菌過濾、去熱源干燥、加穩(wěn)定劑等五.發(fā)酵條件及過程控制復(fù)雜的生物化學(xué)變化過程：動態(tài)過程影響因素：培養(yǎng)基組成，pH、溫度、氧氣泡沫、雜菌污染、噬菌體感染等通過觀察和控制這些工藝條件控制和完成發(fā)酵過程

1.pH變化及控制影響微生物生長繁殖、代謝產(chǎn)物積累

1）影響酶的活性，影響膜的通透性，影響微生物營養(yǎng)吸收及代謝產(chǎn)物分泌

2）影響營養(yǎng)物質(zhì)的分解或中間代謝產(chǎn)物解離影響微生物對這些物質(zhì)的利用

3）原因：菌種特性，培養(yǎng)基配比、發(fā)酵條件

糖產(chǎn)酸，尿素等被分解可引起pH升高

4）調(diào)解培養(yǎng)基配方或通過補料控制

2.發(fā)酵溫度與控制

1）最適溫度:

發(fā)酵前期:菌體生長發(fā)酵后期:產(chǎn)物形成谷氨酸產(chǎn)生菌:

生長溫度為30-32℃

發(fā)酵溫度為34℃

2）不同菌齡對溫度敏感性不同分裂期對溫度敏感種子培養(yǎng)、發(fā)酵初期:嚴格控制溫度發(fā)酵后期：對溫度不太敏感

3）溫度影響酶的活動，影響代謝

4）生物熱，溫度控制系統(tǒng)

3.溶解氧與控制

1）溶解氧與細胞內(nèi)生物氧化的關(guān)系

2）氧在培養(yǎng)液中的飽和度只有(0.0032mg/L)

隨溫度升高和溶質(zhì)濃度增加而變化

3）發(fā)酵中消耗溶解氧0.32-0.8mg/L/h

溶解氧只能維持微生物正常呼吸14-36秒

4）菌種、菌齡、培養(yǎng)基成分對利用氧有區(qū)別

5）供氧方式：攪拌

4.泡沫形成與控制

1）泡沫產(chǎn)生：蛋白質(zhì)與小氣泡混合結(jié)果

2）泡沫中的空氣有隔熱作用，造成培養(yǎng)基滅菌不徹底，有時從排氣口溢出，容易污染

3）消泡劑：天然油脂類和化學(xué)合成類化學(xué)消泡劑：聚氧丙基甘油醚聚氧乙烷甘油醚

4）消泡機理泡沫表層存在極性表面活性物質(zhì)形成雙電層加入帶有相反電荷的表面活性劑降低泡沫機械強度降低表面粘度促進泡沫破裂

5.雜菌污染

1）純菌培養(yǎng)發(fā)酵雜菌：生產(chǎn)菌種外的其他微生物

2）影響：發(fā)酵產(chǎn)物復(fù)雜，有毒物質(zhì)產(chǎn)生，產(chǎn)物分離、提純困難，倒罐

3）原因：設(shè)備、種子或發(fā)酵操作過程污染

4）如何防止雜菌污染無菌實驗檢查培養(yǎng)基：檢查有無雜菌、芽孢種子帶雜菌檢查：微生物純種分離檢查發(fā)酵設(shè)備：死角或固形物堆積6.噬菌體污染

1）特征糖、氮等營養(yǎng)成分消耗遲緩

pH異常產(chǎn)生大量泡沫發(fā)酵液發(fā)粘產(chǎn)物減少或停止發(fā)酵液氣味改變細菌自溶發(fā)酵液變清

2）措施：選育抗噬菌體菌株菌種妥善保藏保持環(huán)境清潔發(fā)酵液中加入噬菌體抑制劑

第二節(jié)微生物發(fā)酵生產(chǎn)酒精一、發(fā)酵法酒精生產(chǎn)的傳統(tǒng)技術(shù)

1.相關(guān)微生物糖化劑所用霉菌有曲霉與根霉兩大類常用曲霉主要有：米曲霉、黑曲霉NRRL330、臭曲霉、海棗曲霉和黑曲霉AS3.4309。常用根霉主要有魯氏毛霉、日本根霉、東京根霉及爪哇根霉。國外常用的酵母菌，以RasseⅡ及RasseⅫ最為有名；我國所用的酵母菌多為釀酒酵母K(淀粉質(zhì)為原料)和臺灣酵母(糖蜜為原料)。2.

淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精酒精發(fā)酵所用糖化劑最初是麥芽，但因其價高而不再使用。固體曲黃曲，發(fā)酵效率約75％－80％，后改用黑曲，發(fā)酵效率提高至90％－92％。固體曲操作不便，不適合大規(guī)模生產(chǎn)，以后改用液體曲，為酒精工業(yè)一大革新。3.

糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)酒精糖蜜有甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜兩種生產(chǎn)工藝都是先將糖蜜稀釋后，加入硫酸銨、氯化鈉、硫酸或鹽酸等營養(yǎng)鹽，再加熱滅菌，供制備發(fā)酵醪之用。采用純菌培養(yǎng)的酵母菌一般用連續(xù)發(fā)酵法來生產(chǎn)酒精，但該法漸目前被固定化酵母細胞法所代替。二、發(fā)酵法酒精生產(chǎn)的新技術(shù)目前，世界各國酒精生產(chǎn)大都采用固定化酵母或活性干酵母進行連續(xù)發(fā)酵工藝

(一)應(yīng)用酶解纖維素原料生產(chǎn)酒精

1.由纖維素發(fā)酵生產(chǎn)酒精采用纖維素酶來水解纖維素酶的來源：里斯木霉(綠色木霉)、熱纖梭菌、發(fā)酵單胞菌等微生物來源：一般是從自然界真菌中進行篩選，得到纖維素酶活力最強的野生型菌株，再經(jīng)紫外線或亞硝基胍人工誘變，使得纖維素酶活力逐漸提高，再按一般發(fā)酵方法進行發(fā)酵2.由半纖維素發(fā)酵生產(chǎn)酒精先用稀酸水解為戊糖，再由細菌可以轉(zhuǎn)變戊糖為乙醇微生物代表種：嗜水氣單胞菌、多黏芽孢桿菌和產(chǎn)吲哚氣桿菌以及梭菌屬中的熱氫硫酸梭菌等(二)酒精發(fā)酵微生物的改良

酒精發(fā)酵微生物以α-淀粉酶產(chǎn)生菌、糖化酶產(chǎn)生菌和酵母菌為主，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，酒精發(fā)酵微生物的育種大有進展。耐高溫α-淀粉酶的應(yīng)用糖化酶產(chǎn)生菌的選育酒精酵母的選育在傳統(tǒng)酒精發(fā)酵工藝中，所用的糖質(zhì)量濃度一般在0.16～0.25g/ml范圍內(nèi)，所用的酵母菌只能產(chǎn)生體積分數(shù)為6％～12％的乙醇，更高的底物濃度和乙醇濃度對酵母菌生長和發(fā)酵會產(chǎn)生抑制作用。

(三)應(yīng)用細菌的酒精發(fā)酵法

運動發(fā)酵單胞菌已成為釀酒酵母之外發(fā)酵生產(chǎn)酒精的第二大菌種優(yōu)點：①耐高糖能力（400g/L）；②耐乙醇能力高（100g/L）；③低生物產(chǎn)量和高乙醇收率（在厭氧條件下，每消耗1mol/L葡萄糖，可得1.9mol/L乙醇）；④比生產(chǎn)速率和發(fā)酵速度快。缺點：①底物范圍狹窄，只有以葡萄糖和果糖為碳源有良好效果，②會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物果聚糖和山梨醇，③細菌發(fā)酵容易染菌，對pH值的控制上也比酵母嚴格得多，④該菌培養(yǎng)時會分泌一種胞外物，導(dǎo)致培養(yǎng)基黏度增加和形成穩(wěn)定的泡沫等高溫菌的選育(四)應(yīng)用固定化細胞生產(chǎn)酒精

應(yīng)用固定化酵母細胞連續(xù)生產(chǎn)酒精應(yīng)用固定化細菌細胞連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)酒精優(yōu)勢：發(fā)酵法生產(chǎn)酒精需要多個大型發(fā)酵罐，不但設(shè)備繁雜，操作困難，而且要耗費一部分糖供酵母生長用，連續(xù)發(fā)酵、酵母再循環(huán)法使用的結(jié)果也不理想。采用固定化技術(shù)，可以一邊流入糖蜜培養(yǎng)基，一邊即可排出發(fā)酵終了的醪液，可連續(xù)發(fā)酵一個月至幾個月，可以只用一個反應(yīng)塔代替多個發(fā)酵罐，發(fā)酵時間大大縮短.第三節(jié)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)藥用氨基酸發(fā)酵法：直接發(fā)酵法：野生菌株發(fā)酵、營養(yǎng)缺陷型突變發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵和營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株發(fā)酵。添加前體法生產(chǎn)氨基酸的大國為日本和德國。日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭。它們能生產(chǎn)高品質(zhì)的氨基酸,可直接用于輸液制劑的生產(chǎn)。日本在美國、法國等建立了合資的氨基酸生產(chǎn)廠家,生產(chǎn)氨基酸和天冬甜精等衍生物。

國內(nèi)生產(chǎn)氨基酸的廠家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前無論生產(chǎn)規(guī)模及產(chǎn)品質(zhì)量還難于與國外抗衡。在80年代中后期,我國從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿(mào)合作的方式引進輸液制劑的制造技術(shù)和仿造產(chǎn)品,1991年銷售量為二千萬瓶,1996年達六千萬瓶,主要廠家有無錫華瑞,北京費森尤斯,昆明康普萊特,但生產(chǎn)原料都依賴進口。據(jù)專家估計,到2000年,世界氨基酸產(chǎn)值可達45億美元,占生物技術(shù)市場的7%,國內(nèi)的氨基酸產(chǎn)值可達40億元,占全國發(fā)酵產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值的12%。氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烴碳源濃度過高時，對菌體生長不利，氨基酸的轉(zhuǎn)化率降低。菌種性質(zhì)、生產(chǎn)氨基酸種類和所采用的發(fā)酵操作決定碳源種類2、氮源：銨鹽、尿素、氨水；同時調(diào)整pH值。營養(yǎng)缺陷型添加適量氨基酸主要以添加有機氮源水解液。需生物素和氨基酸，以玉米漿作氮源。尿素滅菌時形成磷酸銨鎂鹽，須單獨滅菌。可分批流加。氨水用pH自動控制連續(xù)流加3、合適C/N氮源用于調(diào)整pH。合成菌體生成氨基酸，因此比一般微生物發(fā)酵的C/N高。4、磷酸鹽：對發(fā)酵有顯著影響。不足時糖代謝受抑制。5、鎂：是已糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶和羧化酶的激活劑，并促進葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力。6、鉀：促進糖代謝。谷氨酸產(chǎn)酸期鉀多利于產(chǎn)酸，鉀少利于菌體生長。7、鈉：調(diào)節(jié)滲透壓作用，一般在調(diào)節(jié)pH值時加入。8、錳：是許多酶的激活劑。9、鐵：是細胞色素、細胞色素氧化酶和過氧化氫酶的活性基的組成分，可促進谷氨酸產(chǎn)生菌的生長。10、銅離子：對氨基酸發(fā)酵有明顯毒害作用。11、生長因子：生物素作用：影響細胞膜透性和代謝途徑。濃度：過多促進菌體生長，氨基酸產(chǎn)量低。過少菌體生長緩慢，發(fā)酵周期長。與其它培養(yǎng)條件的關(guān)系：氧供給不足，生物素過量時，發(fā)酵向其它途徑轉(zhuǎn)化。種類：玉米漿、麩皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜為來源pH對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制作用機理：主要影響酶的活性和菌的代謝?？刂苝H方法：流加尿素和氨水流加方式：根據(jù)菌體生長、pH變化、糖耗情況和發(fā)酵階段等因素決定?？刂疲海?）菌體生長或耗糖慢時，少量多次流加尿素，避免pH過高（2）菌體生長或耗糖過快時，流加尿素可多些，以抑制菌體生長。（3）發(fā)酵后期，殘?zhí)巧?，接近放罐時，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困難。（4）氨水對pH影響大，應(yīng)采取連續(xù)流加。溫度對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制菌體生長達一定程度后再開始產(chǎn)生氨基酸，因此菌體生長最適溫度和氨基酸合成的最適溫度是不同的。菌體生長溫度過高，則菌體易衰老，pH高，糖耗慢，周期長，酸產(chǎn)量低。采取措施：少量多次流加尿素，維持最適生長溫度，減少風(fēng)量等，促進菌體生長。氧對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸發(fā)酵：生物合成與TCA循環(huán)有關(guān)。適宜在缺氧條件下進行的亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸發(fā)酵：菌體呼吸受阻時產(chǎn)量最大。供氧不足時產(chǎn)酸受輕微影響的天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵谷氨酸生產(chǎn)工藝工業(yè)化生產(chǎn)開始于由水解小麥面筋或大豆蛋白質(zhì)而制取。1957年，日本率先采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，并投入大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，這是被譽為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的重大創(chuàng)舉，使發(fā)酵工業(yè)進入調(diào)節(jié)代謝的調(diào)控階段。目前世界產(chǎn)谷氨酸鈉30噸/年，占氨基酸總量的2/3。我國現(xiàn)已有200余家生產(chǎn)，年產(chǎn)量達15萬噸，居世界首位。產(chǎn)生菌株特點：革蘭氏陽性不形成芽胞沒有鞭毛，不能運動需要生物素作為生長因子在通氣條件下才能產(chǎn)生谷氨酸。谷氨酸生物合成機理：由三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脫氫酶和氫供體存在下進行還原性氨化作用而得到。調(diào)漿：干淀粉用水調(diào)成10-11Bx的淀粉乳，加鹽酸0.5-0.8％至pH1.5。糖化：蒸汽加熱，加壓糖化25min。冷卻至80℃下中和。中和：燒堿中和，至pH4.0-5.0脫色：活性炭脫色和脫色樹脂。活性炭用量為0.6-0.8％，在70度及酸性條件下攪拌后過濾。酶法糖化：以大米或碎米為原料時采用一、淀粉水解糖的制備：酸水解或酶水解大米進行浸泡磨漿，再調(diào)成15Bx，調(diào)pH6.0，加細菌a-淀粉酶進行液化，85℃30min，加糖化酶60℃糖化24h，過濾后可供配制培養(yǎng)基;糖蜜原料：不宜直接用來作為谷氨酸發(fā)酵的碳源，因含豐富的生物素。預(yù)處理方法：活性碳或樹脂吸附法和亞硝酸法吸附或破壞生物素。也可以在發(fā)酵液中加入表面活性劑吐溫60或添加中青霉素。1、斜面培養(yǎng)：主要產(chǎn)生菌是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬、節(jié)桿菌屬。我國各工廠目前使用的菌株主要是鈍齒棒桿菌和北京棒桿菌及各種誘變株。生長特點：適用于糖質(zhì)原料，需氧，以生物素為生長因子。斜面培養(yǎng)基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉組成的pH7.0-7.2瓊脂培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)18-24h。二、菌種擴大培養(yǎng)2、一級種子培養(yǎng)：由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳組成。pH6.5-6.8。1000ml裝200-250ml振蕩，32℃培養(yǎng)12h。3、二級種子培養(yǎng)：用種子罐培養(yǎng)，料液量為發(fā)酵罐投料體積的1％，用水解糖代替葡萄糖，于32℃進行通氣攪拌7-10h。種子質(zhì)量要求：二級種子培養(yǎng)結(jié)束時，無雜菌或噬菌體污染，菌體大小均一，呈單個或八字排列?；罹鷶?shù)為108-109/ml。

三、谷氨酸發(fā)酵1、適應(yīng)期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。措施：接種量和發(fā)酵條件控制使期縮短。2、對數(shù)生長期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急劇下降后維持在一定水平。菌體濃度迅速增大，菌體形態(tài)為排列整齊的八字形。不產(chǎn)酸。12h。

措施：及時供給菌體生長必須的氮源及調(diào)節(jié)pH，在pH7.5-8.0時流加尿素；維持溫度30-32℃3、菌體生長停止期：谷氨酸合成。措施：提供必須的氨及pH維持在7.2-7.4。大量通氣，控制溫度34-37℃。4、發(fā)酵后期：菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑?。措施：營養(yǎng)物耗盡酸濃度不增加時，及時放罐。發(fā)酵周期一般為30h。谷氨酸發(fā)酵控制（1）生物素：作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA的輔酶，參與脂肪酸的生物合在，進而影響磷酯的合成。當(dāng)磷酯含量減少到正常時的一半左右時，細胞發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內(nèi)滲出，積累于發(fā)酵液中。生物素過量，則發(fā)酵過程菌體大量繁殖，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，你謝產(chǎn)物中乳酸和琥珀酸明顯增多。（2）種齡和種量的控制一級種子控制在11-12h，二級控制在7-8h。種量為1％。過多，菌體嬌嫩，不強壯，提前衰老自溶，后期產(chǎn)酸量不高。（3）pH。發(fā)酵前期，幼齡細胞對pH較敏感，pH過低，菌體生長旺盛，營養(yǎng)成分消耗大，轉(zhuǎn)入正常發(fā)酵慢，長菌不長酸。谷氨酸脫氫酶最適pH為7.0-7.2，轉(zhuǎn)氨酶最適pH7.2-7.4。在發(fā)酵中后期，保持pH不變。過高轉(zhuǎn)為谷氨酰胺，過低氨離子不足。（4）通風(fēng)：不同種齡、種量，培養(yǎng)基成分，發(fā)酵階段及發(fā)酵罐大小要求通風(fēng)量不同。在長菌體階段，通風(fēng)量過大，生物素缺乏，抑制菌體生長。在發(fā)酵產(chǎn)酸階段，需要大量通風(fēng)供氧，以防過量生成乳酸和琥珀酸，但過大通風(fēng)，則大量積累a-酮戊二酸。防止噬菌體和雜菌的污染從空氣過濾、培養(yǎng)基、設(shè)備、環(huán)境等環(huán)節(jié)嚴格把關(guān)。四、谷氨酸的提取1、等電點法：操作簡單，收率60％。周期長，占地面積大。2、離子交換法：用陽離子交換樹脂提取吸附谷氨酸形成的陽離子，再用熱堿洗脫，收集相應(yīng)流分，再加鹽酸結(jié)晶。谷氨酸發(fā)酵研究新進展繼續(xù)選育各種生化突變菌株：轉(zhuǎn)化率提高，或可在富含生物素的培養(yǎng)基中保持較高產(chǎn)酸水平。提高原料利用率，拓寬原料來源或簡化操作工藝。生物工程新技術(shù)的應(yīng)用：體外DNA重組的基因工程和原生質(zhì)體融合技術(shù)和固定化細胞技術(shù)使產(chǎn)量提高近1倍。改進發(fā)酵工藝：開拓原料，改進流加工藝，通過電子計算機控制發(fā)酵條件。非糖質(zhì)原料的谷氨酸發(fā)酵醋酸發(fā)酵谷氨酸機理：醋酸形成乙酰CoA，再進入TCA，因此凡能利用葡萄糖原料的菌種也可作為醋酸發(fā)酵谷氨酸的菌株。以醋酸鈉或醋酸銨與醋酸的混合液為原料，且濃度不超過4％。發(fā)酵過程中也需流加以保持pH。已發(fā)現(xiàn)的酶近3000種應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)藥、遺傳工程、分析研究領(lǐng)域的酶有2500種工業(yè)生產(chǎn)商品酶50－60種大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的有10多種研究用商品酶300－400種第四節(jié)微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑

在工業(yè)用酶中蛋白酶占59%，堿性25%、中性12%、糖化酶占13%、-淀粉酶5%、葡萄糖異構(gòu)酶6%

果膠酶3%、纖維素酶1%

脂肪酶3%

醫(yī)藥分析與研究用酶10%中國酶制劑:50年代上海主要微生物酶制劑一.淀粉酶的分類及作用方式淀粉:葡萄糖多聚物，直鏈淀粉和支鏈淀粉直鏈淀粉：-1，4糖苷鍵支鏈淀粉：直鏈淀粉基礎(chǔ)上又由-1，6糖苷鍵

連接產(chǎn)生分支直鏈淀粉占10-20%

支鏈淀粉占80-90%

淀粉酶：

催化淀粉水解成糊精、麥芽糖或葡萄糖的一類酶的總稱包括：-淀粉酶（

-amylase）-淀粉酶淀粉1，4葡萄糖苷酶淀粉-1，6葡萄糖苷酶（一）-淀粉酶（-amylase，液化型淀粉酶）從淀粉分子內(nèi)部作用于-1，4糖苷鍵不作用-1，6糖苷鍵、靠近-1，6糖苷鍵的-1，4糖苷鍵

結(jié)果：麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖帶有支鏈的寡糖使淀粉溶液的黏度下降

1.產(chǎn)生菌細菌：枯草桿菌（Bacillussubtilis）

地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）

解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）

嗜堿芽孢桿菌（B.alkalophilus）

多粘芽孢桿菌（B.polymyxa）

嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus）

施氏假單胞菌（Pseudomonasstutzeri）放線菌:

灰色鏈霉菌（Streptomyces

griseus）

霉菌:

毛霉（Mucor)

根霉（Rhizopus）

曲霉（Aspergillus）2.細菌-淀粉酶的生產(chǎn)（液體深層發(fā)酵）

工藝流程：斜面菌種孢子懸液種子擴大培養(yǎng)罐發(fā)酵熱處理鹽析壓濾干燥粉碎成品

霉菌-淀粉酶主要以固體曲生產(chǎn)

工藝流程：斜面菌種三角瓶菌種種曲厚層通風(fēng)培養(yǎng)粉碎抽提過濾沉淀壓濾烘干等3.-淀粉酶的提取工業(yè)用酶：

1）沉淀(硫酸胺或酒精)

-淀粉酶同菌體一起析出過濾、干燥和粉碎粗酶制劑

2）發(fā)酵液中加入穩(wěn)定劑直接噴霧干燥

3）用淀粉吸附回收酶4.-淀粉酶的純化發(fā)酵液離心去菌體硫酸胺鹽析淀粉吸附丙酮分段DEAE-纖維素柱層析Sephadex

G-100凝膠過濾透析冷凍干燥純品5.-淀粉酶的性質(zhì)分子量50KD，含一個Ca2+酸性、中性和堿性-淀粉酶-淀粉酶最適pH分別為3.5-4.5，6-7，8-10

最適溫度為50-60C6.-淀粉酶的應(yīng)用

1）消化藥物：黑曲霉酸性-淀粉酶

2）面包工業(yè)：米曲霉-淀粉酶耐熱性較差

3）淀粉液化及棉布退漿耐熱性-淀粉酶7.-淀粉酶的篩選（二）糖化型淀粉酶淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖（一類酶）

1.-淀粉酶從非還原性末端按雙糖單位作用-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽糖不作用-1，6糖苷鍵不能越過-1，6糖苷鍵產(chǎn)物：麥芽糖與極限糊精2.淀粉1，4葡萄糖苷酶以葡萄糖為單位作用于-1，4糖苷鍵生成葡萄糖能躍過-1，6糖苷鍵繼續(xù)作用-1，4糖苷鍵

直鏈淀粉：葡萄糖支鏈淀粉：葡萄糖、帶有-1，6糖苷鍵的寡糖3.淀粉-1，6葡萄糖苷酶（異淀粉酶）專門作用于淀粉分子的-1，6糖苷鍵