第九章 生物芯片及數(shù)據(jù)分析技術(shù)

第九章生物芯片及數(shù)據(jù)分析技術(shù)在20世紀(jì)科技史時(shí)有兩件事是值得大書特書的：

（1）微電子芯片，它是計(jì)算機(jī)和許多家電的心臟，它改變了我們的經(jīng)濟(jì)和文化生活，并已進(jìn)入到每個(gè)家庭；

（2）DNA芯片，它將改變生命科學(xué)的研究方式，革新醫(yī)學(xué)診斷和治療，極大地提高人口素質(zhì)和健康水平。

——美國(guó)《財(cái)富》雜志人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃（humangenomeproject,HGP）是一項(xiàng)國(guó)際性科學(xué)研究計(jì)劃，旨在闡明人類基因組30億個(gè)堿基對(duì)的序列，從物理和功能角度發(fā)現(xiàn)和定位人類基因組基因，破譯人類全遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認(rèn)識(shí)自我。對(duì)人類基因組的研究推動(dòng)了整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展，同時(shí)也形成一門嶄新的科學(xué)——基因組學(xué)（genomics），即研究基因組的科學(xué)。上世紀(jì)70年代，美國(guó)投入巨資的“腫瘤計(jì)劃”擱淺，人們漸漸認(rèn)識(shí)到，包括癌癥在內(nèi)的各種人類疾病都與基因直接或間接相關(guān)。1984年，美國(guó)能源部（DOE）首次探討人類基因組DNA進(jìn)行全序列分析的前景1986年美國(guó)生物學(xué)家、諾貝爾獎(jiǎng)獲得者杜爾貝科(R.Dulbecco)在《science》發(fā)表《癌癥研究的轉(zhuǎn)折點(diǎn)——測(cè)定人類基因組序列》（“人類基因組計(jì)劃的標(biāo)書”）得到熱烈響應(yīng)。1990年10月1日，人類基因組計(jì)劃正式啟動(dòng)。2001年2月，人類基因組序列“工作框架圖”公布2006年5月，最后一條染色體序列被公布2008年1月，個(gè)人基因組計(jì)劃啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃主要研究?jī)?nèi)容以具有遺傳多態(tài)性的遺傳標(biāo)記為位標(biāo)、以遺傳學(xué)距離為圖距的基因組圖。遺傳學(xué)距離以厘摩（centi-Morgan,cM）表示。連鎖的遺傳標(biāo)志之間的重組頻率為1%時(shí)，它們的相對(duì)距離為1cM，相當(dāng)于106bp(1Mb)。

遺傳多態(tài)性標(biāo)記為：RFLP、MS/STR、SNP。以一段已知核苷酸序列的DNA片段（稱為序列標(biāo)簽位點(diǎn)，sequencetaggedsite，STS）為位標(biāo)，對(duì)構(gòu)成基因組的DNA分子進(jìn)行測(cè)定，從而對(duì)某段DNA序列在染色體上的相對(duì)位置做一線性排列。以kb或Mb作為圖距而繪制的基因組圖。核苷酸序列圖即最詳盡的物理圖。通過測(cè)序得到基因組的序列，是一般意義上的人類基因組計(jì)劃。

GeneBank數(shù)據(jù)的快速增長(zhǎng)人類基因組計(jì)劃催生了大量生物數(shù)據(jù)怎樣去研究如此眾多基因的生物信息及其在生命過程中所擔(dān)負(fù)的功能，成了全世界生命科學(xué)工作者共同的課題！傳統(tǒng)核酸印跡雜交的局限性傳統(tǒng)核酸印跡雜交：SouthernBlotting和NorthernBlotting等技術(shù)復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測(cè)目的分子數(shù)量少、低通量(lowthrough-put)等對(duì)核酸序列分析與測(cè)定提出的新要求速度快、效率高高通量（可同時(shí)對(duì)大量核酸序列進(jìn)行檢測(cè)和分析）操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度更高成本低生物芯片技術(shù)正是在這樣的背景下應(yīng)運(yùn)而生。生物芯片技術(shù)定義：是采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子、糖類甚至組織切片和細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、濾膜等載體）的表面，組成高度密集的二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣本中的靶分子雜交，通過特定的儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。原理：分子間特異性相互作用核酸雜交抗原－抗體作用DNA－蛋白質(zhì)間的識(shí)別作用等特點(diǎn)：高通量（一張芯片同時(shí)可分析千上萬的分子）

微型化（可裝入口袋）

自動(dòng)化（技術(shù)自動(dòng)化；結(jié)果分析自動(dòng)化）

低成本（相對(duì)于同時(shí)進(jìn)行大量分子研究而言）

防污染分類：生物芯片DNA芯片（基因芯片）蛋白質(zhì)芯片組織芯片細(xì)胞芯片微陣列芯片芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-a-chip）：生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)?！焉?、化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、生物化學(xué)反應(yīng)、分離檢測(cè)等基本操作單位集成或基本集成于一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學(xué)反應(yīng)過程，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行分析的一種技術(shù)。

生物芯片技術(shù)流程第一節(jié)DNA芯片（DNAchip）又稱為基因芯片（Genechip）或DNA微陣列（DNAMicroarray）。將大量已知的探針（寡核苷酸片段或DNA片段）固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品DNA按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交（探針能夠在基因混合物中識(shí)別出特定基因），最后通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來對(duì)特定基因進(jìn)行分析。基本環(huán)節(jié)：芯片制作樣品制備分子雜交檢測(cè)分析DNA芯片實(shí)驗(yàn)流程

DNA芯片制作就是根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?，將設(shè)計(jì)好的檢測(cè)探針通過一定的方法固定到固相支持物上。

主要有兩種：原位合成法和直接點(diǎn)樣法原位合成法和直接點(diǎn)樣法的比較DNA芯片的基本構(gòu)造1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜2.探針：高密度的探針序列按照一定的次序固定在支持物上，每個(gè)位點(diǎn)的序列是已知的外觀探針支持物剖面圖平面局部放大DNAmicroarraysonglassslides樣品制備（DNA、mRNA）——與一般的核酸提取比較類似，只不過為了降低污染和提高檢測(cè)靈敏度增加了純化、擴(kuò)增（PCR）和標(biāo)記。生物素常用標(biāo)記物：熒光素待測(cè)樣品（用Cy3-dUTP標(biāo)記）

對(duì)照樣品（Cy5-dUTP）

以表達(dá)譜芯片為例：

提取樣本組織細(xì)胞中的mRNA（樣本要新鮮并有代表性）

對(duì)提取的mRNA進(jìn)行純化

逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（可進(jìn)行PCR以提高靈敏度）

以雙鏈cDNA為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄（熒光標(biāo)記在此滲入）分子雜交——是已標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行反應(yīng)后產(chǎn)生一系列信息的過程。與傳統(tǒng)的核酸分子雜交相同，但要求更高：選擇合適的反應(yīng)條件、減少生物分子之間的錯(cuò)配率。

考慮雜交反應(yīng)體系中鹽濃度、探針GC含量和所帶電荷、探針與芯片之間連接臂的長(zhǎng)度及種類、檢測(cè)基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

利用生物素標(biāo)記的，在此染色（常用抗生蛋白鏈菌素-藻藍(lán)蛋白）檢測(cè)分析——利用專門的芯片掃描儀對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行圖象采集和分析。

熒光標(biāo)記陽性雜交圖基因芯片檢測(cè)結(jié)果不同的顏色代表一個(gè)探針點(diǎn)雜交上的帶熒光標(biāo)記的核酸分子數(shù)的差異。紅〉黃〉綠〉蘭〉紫DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用DNA測(cè)序：雜交測(cè)序（SBH）疾病診斷：尋找和檢測(cè)與疾病相關(guān)的基因及在RNA水平上檢測(cè)致病基因的表達(dá)用藥個(gè)體化分析：藥物篩選：基因表達(dá)研究：利用DNA芯片進(jìn)行雜交測(cè)序的原理雜交測(cè)序技術(shù)（SBH）可大規(guī)模地檢測(cè)和分析DNA的變異及多態(tài)性。突變疾病診斷1、用于診斷遺傳性疾病例：上海聯(lián)合基因公司開發(fā)了β-地中海性貧血的檢測(cè)芯片2、用于病原體的檢出和確定例：西安聯(lián)爾公司開發(fā)了呼吸道病原體診斷芯片，可檢出多種引起呼吸道感染的病原體。3、腫瘤的基因診斷

例：Affymetrix公司，把P53基因全長(zhǎng)序列和已知突變的探針集成在芯片上，制成P53基因芯片，將在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。藥物篩選利用DNA芯片技術(shù)可比較正常組織（細(xì)胞）與病變組織（細(xì)胞）中大量相關(guān)基因表達(dá)的變化，從而發(fā)現(xiàn)一組疾病相關(guān)基因作為藥物篩選靶標(biāo)。應(yīng)用DNA芯片還可直接篩選特定的基因文庫以尋找藥物作用的靶點(diǎn)。表達(dá)譜芯片是DNA芯片中最常用的一種芯片。Affymetrix基因表達(dá)譜芯片的實(shí)驗(yàn)流程

生物信息學(xué)分析——基因芯片讀數(shù)實(shí)際上是掃描后的信號(hào)強(qiáng)度，是一種相對(duì)值。不同芯片之間要經(jīng)過以看家基因作為對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)化處理才有可比性。常用GAPDH或β-actin基因歸一化的數(shù)據(jù)1、差異基因的篩選倍數(shù)差異FoldChange=SignalA/SignalB（即待比較的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化以后的信號(hào)相除所得的值）

——常用標(biāo)準(zhǔn)Ratio（0.5，2.0）顯著性差異p值：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)，p<0.05為顯著性差異，p<0.01為強(qiáng)顯著性差異

——生物學(xué)重復(fù)不少于3個(gè)每個(gè)探針點(diǎn)的Flag值/Call值：表達(dá)譜芯片中常用A、P、M來表示該探針點(diǎn)信號(hào)與背景信號(hào)的差異

——A-Absent：無顯著性差異

P-Present：有顯著性差異

M-Marginal：差異介于A和P之間

——要求比較的兩組，至少有一組內(nèi)不出現(xiàn)A火山圖（Volcanoplot）散點(diǎn)圖（Scatterplot）視圖分析

聚類分析將基因與最相關(guān)的表達(dá)譜放在一起，分析的基礎(chǔ)是總基因組的線性相關(guān)。生物系統(tǒng)的有序性質(zhì)可以保證聚類分析方法會(huì)揭示出生物行為的有趣特征。GO（GeneOntology）分析

——尋找不同樣品的差異基因可能和哪些基因功能的改變有關(guān)。分類：分子功能（MolecularFunction）生物過程（biologicalprocess）細(xì)胞組成（cellularcomponent）常用數(shù)據(jù)庫：

DAVID、GATHER、PANTHER等

表健脾益氣法相關(guān)差異基因GO分類（DAVID6.7）KEGGpathway分析

常用數(shù)據(jù)庫：

DAVID、BIORAG（BioResourceforArrayGenes）等

——包括圖解的細(xì)胞生化過程如代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳遞、細(xì)胞周期，及同系保守的子通路等信息

深入分析：涉及Gq蛋白激活的花生四烯酸-HETEs代謝通路表健脾益氣法相關(guān)差異基因信號(hào)通路分析（DAVID6.7）蛋白分子相互作用分析

常用數(shù)據(jù)庫：

STRING、pSTIING等String9.05在線分析pSTIING在線分析單基因分析

常用數(shù)據(jù)庫：

美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）歐洲生物信息研究所（EBI）蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片（Prochip）

——與DNA芯片比較類似，只不過蛋白質(zhì)芯片利用的是抗原/抗體、配基/配體（或受體）等蛋白質(zhì)之間的相互作用。蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片與DNA芯片的差異：檢測(cè)方法基本相同

應(yīng)用方向不同制備時(shí)的配基不同、固定條件不同

點(diǎn)樣密度不同結(jié)合反應(yīng)的原理不同

根據(jù)研究目的不同，蛋白芯片的探針可選用某些特定的抗原、抗體、酶和受體等。探針的標(biāo)記主要有：酶標(biāo)記（如辣根過氧化物酶HRP、堿性磷酸酶AP）熒光標(biāo)記（常用Cy3和Cy5）化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記（如吖啶酯）等蛋白質(zhì)芯片探針及其標(biāo)記

分子間的反應(yīng)主要有：①抗原抗體反應(yīng)②蛋白質(zhì)分子與其它蛋白分子或與核酸分子之間的特異性識(shí)別結(jié)合③酶與底物的識(shí)別等通過優(yōu)化合適的反應(yīng)條件使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，可以減少生物分子之間的錯(cuò)配比率。蛋白質(zhì)芯片信號(hào)的檢測(cè)對(duì)吸附到蛋白質(zhì)芯片表面靶蛋白的檢測(cè)主要有兩種方式：1、以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的直接檢測(cè)法〈如表面增強(qiáng)激光解析離子化-飛行時(shí)