第八章 吸光光度法

第八章吸光光度法

基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立的分析方法稱為吸光光度法。包括比色法、可見及紫外分光光度法等。本章主要討論可見光區(qū)的吸光光度法。利用可見光進行吸光光度法分析時，通常將被測組分通過化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色化合物，然后進行吸光度的測量。例如：測量鋼樣中Mn的含量，在酸性溶液中將Mn

氧化為MnO4-，然后進行吸光度的測量。與化學(xué)分析法比較它具有如下特點：

（一）靈敏度高吸光光度法常用于測定試樣中1－0.001%的微量組分。對固體試樣一般可測至10-4%。（二）分析微量組分的準確度高例如：含鐵量為0.001%的試樣，如果用滴定法測定，稱量1g試樣，僅含鐵0.01mg，無法用滴定分析法測定。如果用顯色劑1，10-鄰二氮雜菲與亞鐵離子生成橙紅色的1，10-鄰二氮雜菲亞鐵配合物，就可用吸光光度法來測定。Fe2++3(1,10-phen)→[Fe(1,10-phen)3]2+

（三）操作簡便，測定快速（四）應(yīng)用廣泛幾乎所有的無機離子和許多有機化合物都可直接或間接地用分光光度法測定?？捎脕硌芯炕瘜W(xué)反應(yīng)的機理、溶液中配合物的組成、測定一些酸堿的離解常數(shù)等?！?-1

吸光光度法基本原理一、物質(zhì)對光的選擇吸收

當(dāng)光束照射到物質(zhì)上時，光與物質(zhì)發(fā)生相互作用，產(chǎn)生了反射、散射、吸收或透射（p241,圖9-1）。若被照射的是均勻的溶液，則光在溶液中的散射損失可以忽略。

當(dāng)一束由紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等各種顏色的光復(fù)合而成的白光通過某一有色溶液時，一些波長的光被溶液吸收，另一些波長的光則透過。當(dāng)透射光波長在400-700nm范圍時，人眼可覺察到顏色的存在，這部分光被稱為可見光。透射光和吸收光呈互補色，即物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色是與其吸收光呈互補色的透射光的顏色。例如：CuSO4溶液由于吸收了580-600nm的黃色光，呈現(xiàn)的是與黃色呈互補色的藍色。不同波長的光具有不同的顏色，見P294，表9-1。物質(zhì)吸收了光子的能量由基態(tài)躍遷到較高能態(tài)（激發(fā)態(tài)），這個過程叫做物質(zhì)對光的吸收。M（基態(tài)）+hυ→M*(激發(fā)態(tài))當(dāng)照射光光子的能量hυ與物質(zhì)的基態(tài)與激發(fā)態(tài)能量之差相等時，即ΔE=hυ，才能發(fā)生吸收。不同的物質(zhì)由于結(jié)構(gòu)不同而具有不同的能級差，所以吸收不同波長的光。物質(zhì)對不同波長光吸收能力的分布情況，稱為吸收曲線，也稱為吸收光譜。吸收曲線以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標。每種物質(zhì)的吸收曲線，一般都有一個最大吸收峰，最大吸收峰所對應(yīng)的波長叫做最大吸收波長λmax。由P242，圖9-3可以看出：不同濃度的1，10-鄰二氮雜菲亞鐵溶液對不同波長的光吸收情況不同，其最大吸收波長位于510nm，即吸收的是綠光，呈現(xiàn)的是相應(yīng)的互補色橙紅色。當(dāng)溶液濃度增大時，吸光度增大，但最大吸收波長λmax不變。在吸光光度法分析中，一般都在最大吸收波長處測量吸光度。二、光吸收的基本定律１、朗伯-比耳定律

1729年波格（Bouguer）建立了吸光度與吸收介質(zhì)厚度之間的關(guān)系。1760年朗伯（Lambert）用更準確的數(shù)學(xué)方法表達了這一關(guān)系。1852年比耳（Beer）確定了吸光度與溶液濃度及液層厚度之間的關(guān)系，建立了光吸收的基本定律，稱為朗伯-比耳定律。當(dāng)一束平行單色光通過液層厚度為b、吸光物質(zhì)的濃度為c的單一均勻的，非散射的有色溶液時,溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度成正比。A=lgI0/I=abcA：吸光度，A=lgI0/I；T：透光度，T＝I/I0

；I0:入射光強度；I:透射光強度；a稱為吸光系數(shù)；b：液層厚度（光程長度），b的單位為cm；c為吸光物質(zhì)的濃度，若c的單位為g/L，則a的單位為L·g-1·cm-1。當(dāng)c的單位為mol/L，則此時吸光系數(shù)稱為摩爾吸光系數(shù)，用κ表示，單位為L·mol-1·cm-1，它表示1mol/L吸光物質(zhì)，溶液的厚度為1cm時溶液對光的吸收能力。A=κbc

κ=Ma

在分光光度分析的實際工作中，不能直接取1mol/L這樣高的濃度測定摩爾吸光系數(shù)κ值，而是在適宜的低濃度下測量吸光度A，然后通過計算求出κ值。

例：鐵（II）濃度為5.0×10-4g/L，與1，10-鄰二氮雜菲反應(yīng)生成橙紅色的配合物，該配合物在波長508nm，比色皿厚度為2cm時，測得A=0.19，計算該配合物的a及κ。解：a=A/bc=0.19/(2×5.0×10-4)=190L·g-1·cm-1κ=A/bc=0.19/(2×5.0×10-4/55.85)=1.1×104L·moL-1cm-1或κ=Ma＝55.85×190=1.1×104L·moL-1cm-1通常認為κ>104的顯色反應(yīng)是靈敏的，κ<103則是不靈敏的。吸光度具有加合性，即體系總的吸光度等于各組份吸光度之和（設(shè)各吸光物質(zhì)之間沒有互相作用）。A總=A1+A2+……..An

=κ1bc1+κ2bc2+…….κnbcn在吸光度的測量中，有時也用透光率或透光度表示物質(zhì)對光的吸收程度。透光率以T表示:T=I/I0

,則吸光度與透光率之間的關(guān)系為A=lgI0/I=lg1/T。2、偏離朗伯-比耳定律的原因根據(jù)朗伯-比耳定律，當(dāng)吸收池厚度保持不變，以吸光度對濃度作圖時，應(yīng)得到一條通過坐標原點的直線，該直線稱為標準曲線或工作曲線。在相同條件下測得試液的吸光度，從工作曲線上就可以查得試液的濃度。但在實際工作中，常常遇到偏離線性關(guān)系的現(xiàn)象，特別是在溶液濃度較高時，常會出現(xiàn)標準曲線向上或向下彎曲產(chǎn)生負偏離或正偏離（p244,圖9-4）。偏離朗伯-比耳定律的因素可分為物理因素和化學(xué)因素兩大類。（一）物理因素（1）單色光不純朗伯-比耳定律的基本假設(shè)是入射光為單色光，但目前光度分析儀器中，用單色器分光，用狹逢控制光譜帶的寬度，因而投射到吸收溶液的入射光，常常是一個有限寬度的光譜帶，而不是真正的單色光。由于物質(zhì)對不同波長光的吸收程度不同，因而引起了對朗伯-比耳定律的偏離。見P245，圖9-5。詳細推導(dǎo)見P244-245。(2)非平行光或入射光被散射若入射光不垂直通過吸收池，就使通過溶液的實際光程大于吸收池厚度。此外，入射光發(fā)生散射，實測吸光度增大，導(dǎo)致偏離朗伯-比耳定律。

（二）化學(xué)因素

(1)粒子間相互作用朗伯-比耳定律的基本假設(shè)，除要求入射光是單色光外，還假設(shè)吸收粒子之間無相互作用，即彼此是獨立的，因此稀溶液能很好地符合定律。隨濃度增大，粒子之間的相互作用增大，因此高濃度時吸光度與濃度間的關(guān)系就偏離線性關(guān)系。(2)平衡效應(yīng)、酸效應(yīng)、溶劑效應(yīng)溶液中有色化合物的平衡移動會使最大吸收波長發(fā)生變化，使工作曲線產(chǎn)生彎曲。溶液的酸度、溶劑會對有色化合物的形成、分解等產(chǎn)生影響，而使吸收光譜的形狀和最大吸收波長發(fā)生變化，從而導(dǎo)致偏離?！?-2

目視比色法及光度計的基本部件一、目視比色法用眼睛比較溶液顏色的深淺以測定物質(zhì)含量的方法稱為目視比色法。常用的目視比色法是標準系列法。這種方法就是使用一套由同種材料制成的、大小形狀相同的平底玻璃管（稱為比色管），于管中分別加入一系列不同量的標準溶液和待測液，在實驗條件相同的情況下，再加入等量的顯色劑，稀釋至一定刻度，然后從管口垂直向下觀察，比較待測液與標準溶液顏色深淺。若待測液與某一標準溶液顏色深度一致，則說明兩者濃度相等，若待測液介于兩標準溶液之間，則取兩標準液平均值為待測液濃度。

目視法的主要缺點是準確度不高，受主觀觀察影響較大。對于顏色不穩(wěn)定的有色溶液，標準系列不能久存，需在測定時配制，比較麻煩。但其設(shè)備簡單，操作簡便，對于準確度要求不高的常規(guī)分析很方便實用。二、光電比色法、分光光度法光度法與目視比色法相比，具有下列優(yōu)點：(a)用儀器代替人眼測量，消除主觀誤差，提高準確度。(b)當(dāng)溶液中有其他有色物質(zhì)干擾時，目視比色法無法進行而光度法可選擇適當(dāng)?shù)膯紊骱蛥⒈热芤合蓴_。(c)分析大批試樣方便。光度計的基本組成：光源→單色器→吸收池→檢測器光源：可見區(qū)測量一般用鎢絲燈，可發(fā)出波長為320nm-2500nm的連續(xù)光譜作為光源。在近紫外區(qū)測量時采用氫燈或氘燈產(chǎn)生180-375nm的連續(xù)光譜作為光源。單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置。單色器分為棱鏡或光柵（分光光度法）以及濾光片（光電比色法）等色散元件。棱鏡及光柵色散能力較強，可以獲得純度較高的單色光，且可方便地改變測定波長，所以分光光度法的靈敏性、選擇性和準確度都較光電比色法高。吸收池：亦稱比色皿，用于盛吸收試液，能透過所需光譜范圍的光線，可見區(qū)測定可使用玻璃比色皿。紫外區(qū)測定須選用石英比色皿。檢測器：測量吸光度時，并非直接測量透過吸收池的光強度，而是將光強度轉(zhuǎn)為電流進行測量。這種光電轉(zhuǎn)換器件稱為檢測器。有光電池和光電管兩種。檢測器要對測定波長范圍內(nèi)的光有快速、靈敏的響應(yīng)，且所產(chǎn)生的光電流與照射到檢測器上的光強度成正比?！?-3

顯色反應(yīng)和顯色條件選擇一、顯色反應(yīng)和顯色劑

在光度分析中，將試樣中被測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的化學(xué)反應(yīng)叫顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)可分為兩大類，即配位反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，而配位反應(yīng)是最主要的顯色反應(yīng)。與被測組分生成有色物質(zhì)的試劑稱為顯色劑。同一被測組分?？膳c若干種顯色劑反應(yīng)，生成多種有機化合物。選擇顯色反應(yīng)的一般標準：

（一）靈敏度高靈敏度高的顯色反應(yīng)有利于微量組分的測定。摩爾吸光系數(shù)κ的大小是顯色反應(yīng)靈敏度高低的重要標志。一般來說，當(dāng)κ值為104-105時，可認為該反應(yīng)靈敏度較高。例：P250，從Cu2+與四種顯色劑反應(yīng)的κ值判斷，除氨外，其它幾個顯色反應(yīng)的靈敏度都較高。

（二）選擇性好一種顯色劑最好只與一種被測組分起顯色反應(yīng)，但這種試劑實際上非常少，可以通過掩蔽干擾離子或選擇顯色劑與被測組分和干擾離子生成的有色化合物的吸收峰相隔較遠而獲得好的選擇性。（三）顯色劑在測定波長處無明顯吸收這樣可使試劑空白一般較小。

（四）有色化合物的組成要恒定，化學(xué)性質(zhì)要穩(wěn)定這樣可以保證在測定過程中吸光度基本不變。二、顯色條件的選擇顯色反應(yīng)能否滿足光度法的要求，除了主要與顯色劑的性質(zhì)有關(guān)系外，控制好顯色反應(yīng)的條件也是十分重要的。顯色條件包括顯色劑用量、酸度、顯色溫度、顯色時間及干擾的消除。（一）顯色劑的用量M(被測組分)+R（顯色劑）=MR（有色化合物）

為了使顯色反應(yīng)盡可能進行完全，加入適當(dāng)過量的顯色劑是必要的。但也不能過量太多，否則會引起副反應(yīng)，對測定反而不利。在實際工作中，顯色劑的適宜用量是通過實驗求得的。固定被測組分的濃度和其它條件，分別加入不同量的顯色劑，測量吸光度，做吸光度–顯色劑用量曲線。一般有三種情況，見P251，圖9-12，其中（a）最為常見。

在a-b范圍內(nèi)曲線平直，吸光度出現(xiàn)穩(wěn)定值，因此可在a-b間選擇合適的顯色劑用量。（二）溶液的酸度

溶液酸度對顯色反應(yīng)的影響可從金屬離子、顯色劑及有色配合物三方面考慮。 大部分高價金屬離子都易水解，顯然，金屬離子的水解，對于顯色反應(yīng)的進行是不利的，故溶液的酸度不能太低。

顯色劑多是有機弱酸，溶液的酸度影響著顯色劑的離解，并影響顯色反應(yīng)的完全程度。此外，許多顯色劑本身就是酸堿指示劑，溶液的酸度對顯色劑本身的顏色會產(chǎn)生改變。

溶液的酸度對有色配合物的組成及穩(wěn)定性也有影響。因此，某一顯色反應(yīng)最適宜的酸度可通過實驗來確定。固定待測組分及顯色劑濃度，改變?nèi)芤簆H，測定其吸光度，做吸光度-pH關(guān)系曲線，曲線平坦部分對應(yīng)的pH為適宜的酸度范圍。（三）顯色溫度

合適的顯色溫度也必須通過實驗確定，做A-T曲線。（四）顯色時間

有些顯色反應(yīng)較慢，需放置使其顯色完全。有些顯色配合物不夠穩(wěn)定，放置后會產(chǎn)生部分分解，導(dǎo)致吸光度降低，因此適宜的顯色時間必須通過實驗來確定。從加入顯色劑計算時間，每隔幾分鐘測定一次吸光度，繪制A-t曲線，來確定適宜的時間。（五）干擾的消除主要有三種：利用掩蔽反應(yīng)、控制酸度、分離干擾離子。三、顯色劑顯色劑主要分為無機顯色劑和有機顯色劑兩大類，其中有機顯色劑由于大多與金屬離子生成極其穩(wěn)定的鰲合物，顯色反應(yīng)的選擇性和靈敏性都較無機顯色反應(yīng)高，因而廣泛地應(yīng)用于吸光光度分析中。這部分內(nèi)容可參考P253－255。四、三元配合物由于三元配合物具有獨特的分析特性，因而在分析化學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用?！?-4

吸光度測量條件的選擇上節(jié)主要介紹了顯色反應(yīng)和顯色條件的選擇和控制對吸光光度法的影響，為使光度法有較高的靈敏度和準確性，還必須控制適當(dāng)?shù)奈舛葴y量條件。選擇合適的測量條件，可從下面幾個方面考慮：一、入射光波長入射光波長一般選擇溶液具有最大吸收時的波長，以便獲得較高的靈敏度。如果在最大波長處有干擾物質(zhì)的強烈吸收，則可選擇次強吸收峰，見p256,圖9-13。二、參比溶液為了使測得