第二章核酸化學(xué)

第二章核酸化學(xué)Hoppe-seyler霍佩-賽勒(ErnstFelixHoppe-Seyler,1825-1895)，德國人。

1877年首次提出Biochemie這個名詞，譯成英文即Biochemistry，首創(chuàng)蛋白質(zhì)一詞(proteids)。他首次獲得純卵磷脂，曾獲得結(jié)晶血紅素，研究過葉綠素、血液、膿細(xì)胞。FriedrichMiescher瑞士科學(xué)家(1844-1895)

1868年，F(xiàn)riedrichMiescher從外科繃帶上膿細(xì)胞的細(xì)胞核中分離出了一種有機(jī)物質(zhì)，它的含磷量超過任何一個當(dāng)時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有機(jī)化合物并且有很強的酸性，由于這種物質(zhì)是從細(xì)胞核中分離出來的，就稱之為核素(nuclein)。我們現(xiàn)在知道他分離出來時的是混合物脫氧核糖核蛋白。

二十多年后，1889年R.Altman從酵母和動物細(xì)胞核中制得不含蛋白質(zhì)的核酸，命名nucleicacid。OswaldAvery

1944年,加拿大細(xì)菌學(xué)家OswaldAvery(1877-1955)美國生物學(xué)家Macleod和McCarty發(fā)表著名論文,證明DNA是遺傳物質(zhì)。肺炎雙球菌:粗糙型,光滑型

大腸桿菌ＤＮＡ豌豆DNAdsDNA1／7核小體1／6螺線管1／40超螺線管1／5染色單體

人細(xì)胞含有5.74×109bp，總長約2米，壓縮在46個配對的染色體中，總長只有200微米，壓縮比達(dá)104。polydactyly

核酸是由許多單核苷酸通過磷酸二酯鍵連接而成的高分子物質(zhì)，其基本單位是核苷酸，是由上百個甚至幾千萬個核苷酸聚合而成的長鏈。這種長鏈又稱多聚核苷酸。第一節(jié)核酸的種類和化學(xué)組成ErwinChargaff

DNA和RNA在強酸的作用下可以完全水解，得到磷酸、戊糖和堿基三種組分，DNA中的戊糖是D-2-脫氧戊糖，RNA中的戊糖是D-核糖，核酸分解成核苷酸，核苷酸進(jìn)一步分解成核苷和磷酸，核苷進(jìn)一步分解成堿基和戍糖。

在核酸中的含N堿包括嘌呤（purine）和嘧啶（pyrimidine）兩類，RNA中所含的是腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶(adenine、guanine、cytosine、uracil)。DNA中所含的是腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶(thymine)。核酸按其所含的糖不同而分為:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicAcid，簡寫作DNA）核糖核酸（ribonucleicAcid，簡寫作RNA）核酸的種類（一）DNA

真核細(xì)胞內(nèi)DNA主要分布在細(xì)胞核中，占總量的98%以上，不同各生物的細(xì)胞核中的DNA含量有很大差異，但同種生物的體細(xì)胞核中的DNA含量是相同的，而性細(xì)胞核中DNA含量則占有體細(xì)胞的一半，在細(xì)胞核內(nèi)，DNA呈高度卷曲的雙股螺旋鏈狀態(tài)，與堿性蛋白即組蛋白結(jié)合成為染色質(zhì)。每一個染色質(zhì)含一個DNA分子，這個DNA分子沒有分枝，呈線狀。但是，原核細(xì)胞的DNA呈環(huán)狀，存在于擬核內(nèi)。（二）RNA在細(xì)胞內(nèi)的RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，約占90%，不論動、植、微生物細(xì)胞內(nèi)都含有三種主要的RNA。1．核糖體RNA(ribosomalRNA簡寫作rRNA)rRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合而構(gòu)成核糖體(ribosome)，它是合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器，在核糖體內(nèi)有三種分子大小不同的rRNA。rRNA約占總RNA的75-80%。

2．轉(zhuǎn)移RNA（transferRNA簡寫作tRNA）

tRNA分子量最小，約為25000-30000D，核苷酸數(shù)目在75-88之間，占總RNA的10-15%，主要功能是攜帶活化的AA到核糖體上去合成蛋白質(zhì)，起著轉(zhuǎn)移AA的作用。3．信使mRNA(messengerRNA簡稱mRNA)，mRNA只占總RNA的5-19%，核苷酸數(shù)目在1200左右，mRNA在蛋白質(zhì)合成是起著決定氨基酸順序的模板。大腸桿菌的RNA二、核酸的化學(xué)組成(一)堿基:基本堿基的結(jié)構(gòu)與命名(A)(G)(C)(T)(U)DNA中的四種堿基及它們間的氫鍵胞嘧啶胸腺嘧啶鳥嘌啉腺嘌啉TCAG－CH3Ura與DNA分子中的Thy的區(qū)別RNA分子中的四個堿基脫氧核糖

上述的嘌呤或嘧啶堿與核糖或脫氧核糖連接便形成核苷，堿基與戊糖縮合而成有化合物叫核苷，堿基與脫氧戊糖縮合而成的化合物叫脫氧核苷。嘌呤堿以第9位氮與戊糖的第一位碳的半縮醛羥基連接。嘧啶堿則以第1位氮與第一位半縮醛基連接。(二)、核苷(三)核苷酸由核苷和磷酸生成酯，稱為核苷酸。由核糖核苷生成的核苷酸稱為核苷酸(ribonudeotide)由脫氧核糖核苷生成的核苷酸則稱為脫氧核糖核苷酸(deoxyribonudeotide)。磷酸不是同堿基相連，而是同核糖的5’位相連或2’位或3’位相連。ATPdATP4、細(xì)胞內(nèi)核苷酸衍生物環(huán)核苷酸:常見的有3’,5’—環(huán)腺苷酸cAMP、cGMP。它們是傳遞激素作用的媒介物,在細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)中具有重要作用。第二節(jié)DNA的分子結(jié)構(gòu)一、DNA的堿基組成E.charguff規(guī)則:1.體細(xì)胞堿基組成2.不同生物堿基組成3.親緣關(guān)系相近的生物4.A=T、G=C5.A+G=C+TErwinChargaff二、DNA的一級結(jié)構(gòu)

DNA分子中堿基的排列順序叫DNA的一級結(jié)構(gòu)。DNA的水解產(chǎn)物中有堿基、磷酸、脫氧核糖、核苷、核苷酸等，因而推測DNA的骨架結(jié)構(gòu)為:DNA結(jié)構(gòu)書寫方式:三、DNA的二級結(jié)構(gòu)1.Watson和Crick的DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的模型

Watson-Crick的DNA雙螺旋2.0nm結(jié)構(gòu)特征A.兩條脫氧核苷酸鏈的走向：DNA分子由兩條多脫氧核苷酸鏈組成，這兩條鏈都是以磷酸二酯鍵連接起來的磷酸脫氧核糖長鏈骨架，位于外側(cè)，以右旋方式圍繞一個共同的中軸向前旋繞，但二條鏈的方向相反，即一條鏈的走向為3ˊ→5ˊ方向，另一條鏈為5ˊ→3ˊ走向，二者呈逆平行狀態(tài)形成雙螺旋，在螺旋中形成大溝和小溝。嘌呤和嘧啶堿基重疊于螺旋內(nèi)側(cè)，堿基平面與縱軸相互垂直。B.

堿基的配對：

堿基的配對是一條鏈的腺嘌呤與另一條的胸腺嘧啶配對，一條鏈的鳥嘌呤與另一條胞嘧啶配對，A與T形成兩個氫鍵(A=T)G與C之間形成三個氫鍵(G≡C)嘌呤，每個堿基之間配對叫互補堿基，并聯(lián)后的兩條多脫氧核苷酸鏈叫互補鏈，一條鏈的堿基順序確定之后，就可推知另一條鏈的堿基順序。堿基氫鍵配對圖1雙螺旋分子中糖分子與縱軸平行，與堿基平面垂直穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用力為氫鍵和堿基堆積力（即疏水作用）

C.

DNA二級結(jié)構(gòu)呈螺旋上升，旋轉(zhuǎn)過程中每10個核苷酸旋轉(zhuǎn)一圈，螺旋上升一圈，10個核苷酸上升3.4nm，每個核苷酸上升0.34nm，螺旋的直徑2nm。一、堿基堆積力：這是主要的穩(wěn)定因素，因為各個堿基堆積在一起，產(chǎn)生堿基間的范德華引力，使得兩條脫氧多核苷酸鏈成螺旋開穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，堿基堆積力是由于芳香族堿基的π電子之間相互作用而引起的DNA分子中堿基層層堆積，在DNA分子內(nèi)部形成了一個疏水核心，核心內(nèi)幾乎沒有游離水分子，所以使互補的堿基之間形成氫鍵。2.雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性C6H6(benzene)從氫化熱看苯的穩(wěn)定性

堿基堆積力二、堿基對之間的氫鍵：這種力量比堿基堆積力弱。三、磷酸殘基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子(胺類，金屬離子，穩(wěn)定蛋白)之間形成的離子鍵。外來的力量！4、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多態(tài)性

以上介紹的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型是DNA分子在細(xì)胞內(nèi)和水溶液中的主要形式，現(xiàn)在稱為B-DNA，它是相對濕度為92%時，DNA-鈉鹽纖維所呈現(xiàn)的構(gòu)象。在相對濕度為75%，由B-DNA脫水制成的DNA鈉鹽纖維為A-DNA。當(dāng)DNA纖維中的水分再進(jìn)一步減少時就出現(xiàn)C-DNA。A-DNA、B-DNA、C-DNA都是右手螺旋，它們之間只是堿基的平面不再垂直，而出現(xiàn)不同程度的傾角，螺距和每匝螺旋的堿基數(shù)目也發(fā)生了改變。A-DNA、B-DNA、C-DNA都是右手螺旋，它們之間只是堿基的平面不再垂直，而出現(xiàn)不同程度的傾角，螺距和每匝螺旋的堿基數(shù)目也發(fā)生了改變。

但是，Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG單晶的X－射線衍射圖譜時分別發(fā)現(xiàn)這種六聚體的構(gòu)象與上面講到的完全不同。它是左手雙螺旋，在主鏈中各個磷酸根呈鋸齒狀排列，有如“之”字形一樣，因此叫它Z構(gòu)象（英文字Zigzag的第一個字母）。還有，這一構(gòu)象中的重復(fù)單位是二核苷酸而不是單核苷酸；而且Z－DNA只有一個螺旋溝，它相當(dāng)于B構(gòu)象中的小溝，它狹而深，大溝則不復(fù)存在。

Z-DNA研究表明，Z-DNA的形成是DNA單鏈上出現(xiàn)嘌呤與嘧啶交替排列所成的。比如CGCGCGCG或者CACACACA。這種堿基排列方式會造成核苷酸的糖苷鍵的順式和反式構(gòu)象的交替存在。當(dāng)堿基與糖構(gòu)成反式結(jié)構(gòu)時，它們之間離得遠(yuǎn)；而當(dāng)它們成順式時，就彼此接近。嘧啶糖苷鍵通常是反式的，而嘌呤糖苷酸鍵既可成順式的也可成反式的。而在Z-DNA中，嘌呤堿是順式的。這樣，在Z-DNA中嘧啶的糖苷鏈離開小溝向外挑出，而嘌呤上的糖苷鍵則彎向小溝。嘌呤與嘧啶的交替排列就使得糖苷鍵也是順式與反式交替排列，從而使Z－DNA主鏈呈鋸齒狀或“之”字形。Z-DNA生物學(xué)意義這種結(jié)構(gòu)是怎樣生成的？這一結(jié)構(gòu)在天然狀態(tài)下存在嗎？它有什么生物學(xué)意義？人們相信，并用實驗證明細(xì)胞DNA分子中確實存在有Z－DNA區(qū)。而且，細(xì)胞內(nèi)有一些因素可以促使B－DNA轉(zhuǎn)變?yōu)閆－DNA。比如，胞嘧啶第五位碳原子的甲基化。

螺距殘基數(shù)堿基傾斜

A型(75%,Na)2.81120°B型(92%,Na)3.4100°C型(66%,Li)3.19.36°D/Rhybrid2.81120°Z型4.6129°三股螺旋DNADNA三鏈結(jié)構(gòu)環(huán)型DNA

生物體內(nèi)有些DNA是以雙鏈環(huán)形DNA形式存在的，如某些病毒DNA，噬菌體DNA、細(xì)菌質(zhì)粒DNA、真核細(xì)胞中的線粒體DNA、葉綠體DNA等。在細(xì)胞內(nèi)，由于DNA分子與其他分子的相互作用，使DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲成三級結(jié)構(gòu)，超螺旋是DNA三級結(jié)構(gòu)中最常見的形式。BacteriophageLambdaBacteriophageDNA第三節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)RNA的堿基組成：RNA中所含的四種基本堿基是：腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶，此外還含有幾十種修飾堿基。RNA的堿基組成，不象DNA那樣具有嚴(yán)格的A=T，G=C的規(guī)律，因為RNA的結(jié)構(gòu)不象DNA那樣，整個分子都是雙螺旋結(jié)構(gòu)。

RNA的一級結(jié)構(gòu)：

核糖核酸的一級結(jié)構(gòu)很象脫氧核糖核酸，是由許許多多的核糖核苷酸借助3ˊ、5ˊ-磷酸二酯鍵連接而成的多核苷酸鏈，盡管RNA的核糖Cˊ2上有一自由羥基，但不形成2ˊ，5ˊ-磷酸二酯鍵，用牛脾磷酸二酯酶降解天然RNA，酶解產(chǎn)物中只有3ˊ-核苷酸，并無2ˊ-核苷酸。RNA結(jié)構(gòu)圖RNA轉(zhuǎn)錄自DNA一、mRNA

mRNA的一級結(jié)構(gòu)特點：真核細(xì)胞的mRNA5ˊ-末端還有一特殊的結(jié)構(gòu)，m7GpppNm，通稱為“帽子結(jié)構(gòu)”。5ˊ末端的鳥嘌呤N7被甲基化m7G，核苷酸經(jīng)過磷酸與相鄰的核苷酸（N）相連，形成5ˊ、5ˊ-磷酸二酯鍵，這個（N）核苷酸的C2ˊ上也是被甲基化了的，這種特殊的5ˊ末端有抗核酸酶水解的作用。Nm表示N核苷酸的C2ˊ上也是被甲基化了。mRNA5'末端的“帽子”結(jié)構(gòu)真核生物的基因結(jié)構(gòu)啟動子外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄終止子真核基因mRNA的形成極大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA在3ˊ末端連續(xù)200個核苷酸均為腺嘌呤核苷酸殘基，稱為多聚腺苷酸（或稱polyA），原核細(xì)胞的mRNA其3ˊ端一般沒有polyA、polyA的結(jié)構(gòu)與mRNA從細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)的過程有關(guān)，也與mRNA的半衰期有關(guān)。新合成的mRNA、polyA較長，衰老的mRNA分子，polyA短。二、tRNA三葉草結(jié)構(gòu)具有下列共同特點。1.

3ˊ末端起為三個不構(gòu)成堿基對但也不是連接成環(huán)的核苷酸，即C-C-AOH，連接它們的是5ˊ-末端形成7個堿基對的一個螺旋區(qū)，通常稱這一部分為“氨基酸臂”或稱氨基酸接受基），因為在蛋白質(zhì)生物合成中，tRNA運送氨基酸時，氨基酸總是接在3ˊ-末端的腺苷酸上。2.環(huán)I由8至11個不能形成堿基對的核苷酸組成的小環(huán)，接在由3或4個堿基對形成的另一個螺旋區(qū)的一端，此環(huán)因含有5、6-二氫尿嘧啶，故稱為“二氫尿嘧啶環(huán)”（DHU環(huán)）。連接此環(huán)的螺旋區(qū)稱二氫尿嘧啶區(qū)。3.環(huán)Ⅱ為由7個核苷酸組成的小環(huán)，它們也都不能互補為堿基對，接在由5個堿基對級成的另一螺旋區(qū)一端，位于此環(huán)中間部位的三個核苷酸偏成一組，構(gòu)成所謂的“反密碼子”，故稱此環(huán)為“反密碼環(huán)”，連接此環(huán)的5個堿基對組成的螺旋區(qū)稱“反密碼區(qū)”。4.

環(huán)Ⅲ為7個核苷酸組成的小環(huán)，接在由5個堿基對形成的又一螺旋區(qū)的一端，此環(huán)因含有修飾核苷Φ（假尿嘧啶核苷）及T（胸腺嘧啶核糖核苷酸殘基）并必定含有-T-Φ-C的堿基順序，所以又稱為T-Φ-C環(huán)。5.在環(huán)Ⅱ與環(huán)Ⅲ之間，由3-18個核苷酸組成的“附加叉”又可稱額外環(huán)或不變環(huán)，這些核苷酸以含有較多修飾堿基為其特點，它們有的可形成堿基對，稱可變環(huán)或額外環(huán)，有的不能形成堿基對，在不同種類的tRNA中，額外環(huán)的大小很不一致，核苷酸的數(shù)目相差很遠(yuǎn)，所以是tRNA分類的重要指標(biāo)。tRNA三級結(jié)構(gòu)三.rRNA的結(jié)構(gòu)

原核生物和真核生物的核糖體大小不一樣。原核生物（70S）真核生物（80S）核糖體rRNA核糖體rRNA小亞基(30S)16S(40S)18S大亞基(50S)23S、5S(60S)28S、5S、5.8S核糖體由兩個亞基組成，每個亞基由數(shù)十個蛋白質(zhì)和3－4種rRNA組成。核糖體的大亞基和小亞基都有結(jié)合位點,小亞基有與mRNA結(jié)合的部位，大亞基有與tRNA結(jié)合的位點，在核糖體內(nèi)，rRNA以單鏈存在，而且也和tRNA一樣，多核苷酸鏈發(fā)生折疊而形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，同時，也局部呈雙螺旋結(jié)構(gòu)，但是rRNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)沒有DNA穩(wěn)定，它容易因各種因子影響而發(fā)生構(gòu)象變化，如溫度、電解質(zhì)的不同，可以使RNA呈現(xiàn)不同的構(gòu)象。16SrRNA的二級結(jié)構(gòu)5SrRNA30S亞基的三維結(jié)構(gòu)第四節(jié)核酸的理化性質(zhì)

一、核酸紫外吸收:1.嘌呤堿、嘧啶堿具有共軛雙鍵,使堿基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm有吸收,在260nm處最大吸收。C=C-C=C

2.純DNAOD260/OD280=1.8、RNA=2.0,不純的樣品不能用這個方法。這個特性可用來鑒定純度。3.測定核酸含量：A260:1.OD=50μg/ml雙鏈DNA=40μg/ml單鏈DNA、RNA=20μg/ml寡核苷酸二、核酸的解離性質(zhì):

核酸既有酸性基因，又有堿性基因，是兩性電解質(zhì)。磷酸基在pH>4時，H全部解離，呈多陰離子狀態(tài)。高等生物中這種狀態(tài)下的核酸與堿性組蛋白結(jié)合而保持穩(wěn)定。2．堿基的解離也受pH的影響。3．只有在中性條件下才能進(jìn)行正常的堿基配對。4．核酸的pI=2-2.5,中性帶負(fù)電，酸性帶正電。5.不同的核酸分子解離度不同，電性和帶電量不同它們在電場的作用下能向與其相反的電極移動，這種現(xiàn)象，稱為電泳。電泳是分離、鑒定核酸及其片段的常用方法。

1.核酸的變性:

當(dāng)將呈雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA溶液緩慢地加熱時，其中氫鍵便斷開，雙鏈DNA便解脫成為單鏈，這叫做核酸的“熔解”或變性。降解:核酸骨架上的3’,5’-磷酸二酯鍵的斷裂、稱為降解。三、核酸的變性、復(fù)性和分子雜交:2.增色效應(yīng)核酸變性后，增加了A260的光吸收。A260:1.OD=50μg/ml雙鏈DNA1μg/ml=1/50OD=０.０２OD40μg/ml單鏈DNA,RNA1μg/ml=1/40OD=０.０２５OD20μg/ml寡核苷酸1μg/ml=1/20OD=０.０５ODDNA的紫外吸收DNA的變性在紫外吸收上的變化Tm值

當(dāng)DNA從雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)閱捂湹臒o規(guī)則卷曲狀態(tài)時，它在260nm處的吸收便增加，也就是增色效應(yīng)，引起DNA發(fā)生熔解的溫度變化范圍只不過幾度，這個溫度變化范圍的中點稱為熔解溫度（Tm），DNA的Tm值一般在70-85℃之間。

DNA部分變性電鏡圖不同來源DNA的變性曲線變性的影響因素１．DNA分子的Tm與GC含量有關(guān)２．鹽濃度對DNA變性的影響

(二)復(fù)性與退火

當(dāng)將雙股鏈呈分散狀態(tài)的DNA溶解液緩慢冷卻時，它們又可以發(fā)生不同程度的重新結(jié)合，而形成雙股螺旋結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象稱為“退火”（annealing）。在適宜的溫度條件下，分散開的兩條DNA鏈可以完全重新結(jié)合成和原來一樣的雙股螺旋。這個螺旋的重組過程稱為“復(fù)性”（renaturation）。DNA的變性與復(fù)性DNA濃度與復(fù)性時間的關(guān)系T1/2×C＝constCot曲線的另一種表達(dá)形式人類DNA的Cot曲線

哺乳動物的DNA一般均呈右圖的曲線，這是因為它們的基因組DNA中插入了大量的重復(fù)序列，如人的DNA中就插入了長度為350bp的Alu序列達(dá)50萬份拷貝之多。DNA部分變性電鏡圖

5ˊAGCT3ˊ

5ˊAGCT3ˊ3ˊTCGA5ˊ

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Questions5ˊAGCT3ˊ

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Questions:

1.If5ˊACAGCTTTGGT3ˊ

+

3ˊTCGA

5ˊ