第三章 核酸化學(xué)

1第三章核酸化學(xué)2主要內(nèi)容細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)（核酸的分布和分類）核酸的化學(xué)組成核酸的分子結(jié)構(gòu)核酸的性質(zhì)核酸的分離純化核酸的定量測定3DNA(DeoxyribonucleicAcid

)是主要的遺傳物質(zhì)：儲存遺傳信息，將遺傳信息傳遞給子代，物理和化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，有遺傳變異的能力。RNA(RibonucleicAcid

)也是遺傳物質(zhì)：如RNA病毒一、細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)4核酸脫氧核糖核酸（DNA）tRNAmRNArRNA蛋白質(zhì)合成核糖核酸（RNA）5核酸的分布DNA：細胞核（98%）、線粒體、葉綠體RNA：細胞質(zhì)

rRNA：核仁中合成，占總RNA的80%

tRNA：核內(nèi)合成，占總RNA的15%

mRNA：核內(nèi)合成，占總RNA的5%

hnRNA:核不均一RNA

snRNA:核內(nèi)小RNA

snoRNA:核仁小分子RNA6核酸核苷酸核苷磷酸堿基戊糖嘌呤堿嘧啶堿核糖(RNA)脫氧核糖(DNA)二、核酸的化學(xué)組成7堿基嘌呤嘧啶8稀有堿基（修飾堿基）少數(shù)修飾核苷用單字符號如D、ψ、I9戊糖10核苷11糖苷鍵12核苷酸13常見的核苷酸及其縮寫符號14多磷酸核苷酸NMPNDP和NDP（ddNXP）都具有重要的生理功能15常見核苷酸及縮寫核糖核苷酸（RNA）脫氧核糖核苷酸（DNA）核苷一磷酸核苷二磷酸核苷三磷酸脫氧核苷一磷酸脫氧核苷二磷酸脫氧核苷三磷酸Adenosinemonophosphate(AMP)Adenosinediphosphate(ADP)Adenosinetriphosphate(ATP)Deoxyadenosinemonophosphate(dAMP)Deoxyadenosinediphosphate(dADP)Deoxyadenosinetriphosphate(dATP)Guanosinemonophosphate(GMP)Guanosinediphosphate(GDP)Guanosinetriphosphate(GTP)Deoxyguanosinemonophosphate(dGMP)Deoxyguanosinediphosphate(dGDP)Deoxyguanosine(dGTP)Cytidinemonophosphate(CMP)Cytidinediphosphate(CDP)Cytidinetriphosphate(CTP)Deoxycytidinemonophosphate(dCMP)Deoxycytidinediphosphate(dCDP)Deoxycytidinetriphosphate(dCTP)Uridinemonophosphate(UMP)Uridinediphosphate(UDP)Uridinetriphosphate(UTP)Deoxyuridinemonophosphate(dTMP)Deoxyuridinediphosphate(dTDP)Deoxyuridinetriphosphate(dTTP)16特殊的核苷酸高能磷酸鍵水解時釋放出的能量為7.3Kcal/mol，而普通磷酸酯鍵為2Kcal/mol173`，5`-環(huán)化腺苷酸重要的環(huán)化核苷酸，普遍存在于動、植物和微生物細胞中，含量極小，但具有極重要的生理功能，具有放大激素信號的作用。183`，5`-環(huán)化鳥甘酸cGMP具有縮小激素信號的作用。cAMP與cGMP都被稱為第二信使。19三、核酸的分子結(jié)構(gòu)DNA的分子結(jié)構(gòu)DNA的一級結(jié)構(gòu)DNA的二級結(jié)構(gòu)RNA的分子結(jié)構(gòu)DNA的三級結(jié)構(gòu)mRNA的結(jié)構(gòu)tRNA的結(jié)構(gòu)rRNA的結(jié)構(gòu)20鍵型：3`，5`-磷酸二酯鍵；方向：由5`-末端到3`-末端、

一級結(jié)構(gòu)指組成核酸的各核苷酸之間連鍵性質(zhì)及核苷酸排列的順序。核酸是由數(shù)量極其龐大的四種核苷酸以3`，5`-磷酸二酯鍵彼此連接起來的直線形分子核酸的一級結(jié)構(gòu)21一級結(jié)構(gòu)的文字式縮寫pTpGpCpApGpGpTpT或pT-G-C-A-G-G-T-TTGCAGGTTAAAGG它的互補鏈:ACGTCCAATTTCC(誤)CCTTTAACCTGCA(正)3’-ACGTCCAATTTCC-5’(正)22DNA的空間結(jié)構(gòu)

1953年Watson和Crick提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型1962年，Watson和Crick與Wilkins共享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎23A.Chargaff規(guī)律嘌呤與嘧啶的摩爾數(shù)相等：A=T；G=C；A+G=C+TDNA的堿基組成具有種的特異性，但沒有組織的特異性年齡、營養(yǎng)狀態(tài)、環(huán)境的改變不影響DNA的堿基組成DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提出的三個根據(jù)24B.X射線衍射分析1952年M.WilkinsDNANa鹽的X-衍射圖片1921-195825兩條多聚核苷酸鏈組成螺旋直徑堿基的朝向堿基的相關(guān)基團所形成的鍵長和鍵角堿基配對規(guī)則C.DNA分子密度及堿基的物理和化學(xué)數(shù)據(jù)26DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的主要內(nèi)容螺旋的性質(zhì)：由兩條反向平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸盤繞而成的右手雙螺旋

基團的分布：脫氧核糖和磷酸通過3`，5`-磷酸二酯鍵連接成螺旋鏈的骨架，堿基處于螺旋內(nèi)側(cè)，而磷酸及戊糖位于外側(cè)。堿基的平面與螺旋軸相垂直，糖平面與堿基平面幾乎成直角27

3.螺旋參數(shù)：螺旋的直徑為2nm，相鄰堿基在螺旋軸上間距0.34nm，旋轉(zhuǎn)夾角為36°，每10對核苷酸形成螺旋的一圈，螺距為3.4nm。沿著走向，磷酸、戊糖骨架形成深淺不同的凹陷，即大溝和小溝。284.堿基配對：堿基配對嚴格按照互補原則即A與T配對2個氫鍵，G與C配對形成3個氫鍵，兩條鏈借堿基之間的氫鍵和堿基堆積牢固地連為一體。29維持DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用力堿基對間的氫鍵堿基堆積力﹡環(huán)境中的陽離子30DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多態(tài)性因DNA含水量不同31DNA雙鏈線狀雙鏈環(huán)狀單鏈線狀：動物病毒如：微小病毒（parvoviruse)

單鏈環(huán)狀：噬菌體φX174真核細胞染色體DNA噬菌體T2，T5，T7，λ，P22

E.Coli染色體DNA線粒體DNA葉綠體DNA多瘤病毒DNA，病毒SV40DNA噬菌體λ和φX174的復(fù)制型32單鏈核酸形成的二級結(jié)構(gòu)

發(fā)夾結(jié)構(gòu)：單股核酸鏈自身回折

配對產(chǎn)生的反平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)三股或四鏈的DNA結(jié)構(gòu)（復(fù)制或轉(zhuǎn)錄過程）超螺旋拓撲結(jié)構(gòu)DNA的高級結(jié)構(gòu)33DNA的高級結(jié)構(gòu)DNA的超螺旋（三級）結(jié)構(gòu)是指在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上DNA雙螺旋的進一步卷曲。類型：開鏈環(huán)狀、閉鏈環(huán)狀、超螺旋結(jié)構(gòu)34DNA超螺旋的形成及拓撲學(xué)性質(zhì)正超螺旋使螺旋變緊，負超螺旋使螺旋變松連環(huán)數(shù)L：DNA兩條鏈相互纏繞交叉的總次數(shù)盤繞數(shù)T：DNA分子中雙螺旋的周數(shù)超螺旋周數(shù)W：在雙螺旋基礎(chǔ)上，一條螺旋和另一條雙螺旋的纏繞次數(shù)參數(shù)關(guān)系：L=T+W35真核生物的染色體及其組裝真核生物的染色體染色體和染色質(zhì)常染色質(zhì)異染色質(zhì)染色體中的組蛋白

H1，H2A，H2B，H3，H4組蛋白富含堿性的賴氨酸和精氨酸核小體：由DNA和組蛋白形成的染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位。每個核小體由147bp的DNA纏繞組蛋白八聚體近兩圈形成。36螺線管腳手架蛋白37RNA的分子結(jié)構(gòu)

除tRNA外，細胞內(nèi)的RNA幾乎全部與蛋白形成復(fù)合物的形式RNA分子結(jié)構(gòu)的特點：多以單鏈形式存在；單鏈RNA分子內(nèi)在某些區(qū)域局部回折，形成短的雙螺旋區(qū)，進而形成三級結(jié)構(gòu)；沒有參與配對的區(qū)域形成突環(huán)；38兩個基本概念單順反子：每種mRNA分子只編碼一種蛋白質(zhì)的信息，只能作為一種蛋白質(zhì)的翻譯模板。如：真核細胞mRNA多順反子：一個mRNA分子含有幾種蛋白質(zhì)的信息，可以編碼幾種蛋白質(zhì)。如原核生物mRNA。信使RNA（mRNA）的結(jié)構(gòu)39信使RNA（mRNA）的結(jié)構(gòu)真核細胞mRNA分子結(jié)構(gòu)特點：大多數(shù)真核細胞mRNA在3`-末端有一段長約200個殘基的多聚腺苷酸（PolyA）真核細胞mRNA的5`-末端有特殊的帽子結(jié)構(gòu)，稱為“帽子（Cap）”：m7GpppNmAA….AA~200ntPolyA3`-端5`-端帽子結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)40轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）tRNA共同點：分子量較?。?6nt）；有較多稀有堿基（5%~20%）tRNA的3`-末端，皆為CCA；5`末端多數(shù)為pG，也有pC；tRNA的二級結(jié)構(gòu)都呈三葉草形。有“四環(huán)和四臂”結(jié)構(gòu)

6.三級結(jié)構(gòu)為倒L型。41tRNA二級結(jié)構(gòu)具有四環(huán)四臂結(jié)構(gòu)tRNA的三級結(jié)構(gòu)倒L形t氨基酸臂（環(huán)），二氫尿嘧啶環(huán)(臂），又稱D環(huán)(臂），反密碼環(huán)(臂），TψC環(huán)(臂），額外環(huán)42核糖體RNA結(jié)構(gòu)核糖體二級RNA結(jié)構(gòu)復(fù)雜，并常處于動態(tài)變化中；

rRNA在細胞內(nèi)與多種小分子蛋白結(jié)合成核糖體顆粒

43核內(nèi)小RNA(snRNA),70-300nt，負責基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工，5’也有帽子結(jié)構(gòu)核仁小分子RNA:參與rRNA前提的加工非編碼RNA:可能是調(diào)控RNA44四、核酸的性質(zhì)核酸的一般性質(zhì)化學(xué)水解核酸的紫外吸收性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性和分子雜交45核酸的一般性質(zhì)核酸及核苷酸都是兩性電解質(zhì)核酸不溶于一般的有機溶劑，但可溶于乙醇的水溶液核酸有較大的粘度46核酸的化學(xué)水解酸解：溫和條件和稀酸短時處理，DNA和RNA都不降解，提高作用條件可脫嘌呤，濃酸可脫嘧啶堿解：

RNA稀堿條件下易水解成2’和3’核苷酸，中間產(chǎn)物為2’,3’環(huán)核苷酸

DNA稀堿條件下穩(wěn)定，不會發(fā)生水解，但可以解開螺旋而變性據(jù)此性質(zhì)可從RNA制備2’和3’核苷酸47核酸的紫外吸收性質(zhì)最大吸收峰：260nm減色效應(yīng)：大分子的DNA在260nm的消光值，比DNA分子中的各個堿基260nm處的消光值總和小得多，這種現(xiàn)象稱減色效應(yīng)。A260/A280=？48核酸的變性、復(fù)性和分子雜交變性：在一些理化因素的作用下，核酸中堿基間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，變成無規(guī)則線團的現(xiàn)象

引起變性的主要因素：

@溫度升高而引起的變性叫熱變性；@酸堿度的改變引起的變性叫酸堿變性；

@有機溶劑也可以引起核酸變性增色效應(yīng)：核酸變性時，在260nm的消光值顯著增加的現(xiàn)象49解鏈溫度（Tm）：通常指增色效應(yīng)達到最高值的一半時的溫度。退火溫度50與DNA的Tm值有關(guān)的因素DNA的均一性G-C含量G-C%=(Tm-69.3)×2.44介質(zhì)中的離子強度51DNA的復(fù)性與分子雜交復(fù)性：熱變性的DNA，在緩慢冷卻后，分開的雙鏈又可恢復(fù)為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。影響復(fù)性的因素：離子強度溫度DNA的大小DNA的濃度52核酸的分子雜交

熱變性后的DNA片段，在進行復(fù)性時并不能完全回復(fù)到原來的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，這是因為各片段之間只要有一定數(shù)量的堿基彼此互補，不必全部堿基互補，就可以重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，這就是分子雜交技術(shù)的基礎(chǔ)。53Southern凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)54五.核酸的分離純化1.分離純化的一般原則總的要求：去除蛋白質(zhì)等各種雜質(zhì)，保持核酸不發(fā)生變性或降解，最終得到完整而具有天然生物活性的核酸制品。注意事項：（1）避免高溫、強酸和強堿等變性因素，在低溫（0－4度）和pH5－9的條件操作。（2）在制備DNA時要避免機械力的剪切