樣品分析方法

5.1樣品前處理目的：將固體樣品制成溶液；將待測組分提取或游離出來；排除干擾等。選擇樣品處理方法的一般原則：（1）樣品的種類（2）被測藥物的性質(zhì)（3）測定方法專屬性、分離能力、對不純樣品污染的耐受程度等。溶劑萃取法

有機破壞法5.1.1溶劑萃取法分離濃縮方法提高分析的專屬性和靈敏度在中藥材及其制劑的分析中應(yīng)用較多方法：將疏水性的有機溶劑與樣品水溶液充分混合，藥物即在水相和有機相間進(jìn)行分配，選擇合適的有機溶劑和萃取條件，則大多數(shù)藥物會從水相轉(zhuǎn)移至有機溶劑中。1、有機溶劑的選擇（1）與水不相混溶，與水的互溶性盡可能?。?）對待測組分有較好的溶解性能（3）沸點適中，最好低于水的沸點（4）毒性小乙醚可混入1-2%的水分2、pH值藥物以非電離形式存在，易為有機溶劑提取。酸性藥物：pH要低于pka值1~2個pH個單位堿性藥物：pH要高于pkb值1~2個pH值單位中性藥物：離子性藥物：離子對提取法離子對試劑：烷基磺酸鹽、烷基季銨鹽采用緩沖溶液，維持提取效率的重現(xiàn)性。3、提取操作

提取容器：分液漏斗、萃取試管萃取試管：有標(biāo)準(zhǔn)磨口玻璃塞的離心管有機溶劑的用量：根據(jù)被測藥物的溶解度和后一步使用的分析測定方法考慮。有機溶劑：水相（體積比）=1:1或1:2

操作：將樣品、緩沖溶液和萃取溶劑置試管內(nèi)，將試管放在旋渦混合器上旋渦混合進(jìn)行液-液萃取。將試管置離心機內(nèi)離心，使有機相和水相完全分離若需要下層液體，可將毛細(xì)吸管尖端伸入上液層，或通過玻璃水泵將上層液體吸走。（三）有機破壞法有機金屬藥物：金屬原子直接與碳原子等共價結(jié)合含鹵素、S、P等非金屬元素的有機藥物1、干法破壞瓷坩鍋或鉑坩鍋碳酸鈉或氧化鎂等助灰化2、濕法破壞凱氏燒瓶無機混合強酸或強酸-強酸鹽3、氧瓶燃燒法氧瓶燃燒法：將有機藥物放入充滿氧氣的密閉燃燒瓶中進(jìn)行燃燒使其分解，然后將燃燒產(chǎn)物用吸收液吸收，采用適宜的分析方法進(jìn)行分析。特點：簡便、快速、破壞完全，尤其適用于微量樣品的分析。吸收液：水或氫氧化鈉水溶液。每種元素的吸收液在中國藥典中有詳細(xì)規(guī)定。薛立格（Schoniger）于1955年在國際微量化學(xué)會議操作方法將稱取的供試品置于無灰濾紙中心，折疊后，固定于鉑絲下端的彎曲處，使尾部露出;燃燒瓶內(nèi)加入一定量的吸收液，并將瓶頸用水濕潤，急速通入氧氣1～2分鐘，用表面皿覆蓋瓶口，移至有防護(hù)設(shè)備的櫥內(nèi)，點燃包有供試品的濾紙的尾部，迅速放入燃燒瓶中，按緊瓶塞;待燃燒完畢后，充分振搖，使生成的煙霧完全吸入吸收液中，進(jìn)行測定。5.2.1鑒別試驗的目的根據(jù)藥物的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，采用化學(xué)、物理化學(xué)或生物學(xué)方法來判斷其真?zhèn)巍ｈb別試驗用方法僅用于證實貯藏在有標(biāo)簽容器中的藥物是否為其所標(biāo)示的藥物，而非對未知物的鑒別。采用一組試驗項目，全面評價一個藥物，每個藥品一般2～3條。性狀項和物理常數(shù)確認(rèn)鑒別試驗項目原料藥鑒別制劑鑒別鑒別項下規(guī)定的試驗5.2.21、性狀

反映藥物特有的物理性質(zhì)。外觀：指藥物的聚集狀態(tài)、晶型、色澤以及臭、味等性質(zhì)。如二巰基丁二鈉的描述為“本品為白色至微黃色的粉末；有類似蒜的特臭”。溶解度：一定程度上反映了藥品的純度。藥品在不同溶劑中的溶解性能用“極易溶解、易溶、溶解、略溶、微溶、極微溶解、幾乎不溶或不溶”來描述。物理常數(shù)：用于藥品鑒別，反映其純雜程度。藥典收載的物理常數(shù)包括：相對密度、餾程、熔點、凝點、比旋度、折光率、黏度、酸值、皂化值、羥值、碘值、吸收系數(shù)。物理常數(shù)：比旋度：在一定波長與溫度下，偏振光透過長1dm且每1ml中含有旋光性物質(zhì)1g的溶液時測得的旋光度。吸收系數(shù)：通常在同品種制劑的含量測定、溶出度檢查和含量均勻度測定時如果采用吸收系數(shù)法測定時，收載原料的吸收系數(shù)。這兩種物理常數(shù)可用以區(qū)別藥品、檢查純度或測定制劑的含量。

某一類藥物組成中的陰離子和陽離子的特殊反應(yīng)或典型的有機官能團(tuán)反應(yīng)。

中國藥典附錄收載一般鑒別試驗（附錄20）：丙二酰脲類、托烷生物堿類、芳香第一胺類、有機氟化物類、無機金屬鹽類、有機酸鹽、無機酸鹽2、一般鑒別試驗3、專屬鑒別試驗藥物分子中的特殊基團(tuán)或官能團(tuán)特殊反應(yīng)或典型的有機官能團(tuán)反應(yīng)。如四氮唑法:C17位上有α-醇酮基的皮質(zhì)激素。5.2.3鑒別方法與原理（一）化學(xué)法1、呈色反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)3、氣體生成反應(yīng)4、焰色反應(yīng)（二）光譜法1、紫外光譜法2、紅外光譜法3、熒光法（三）色譜法TLC、HPLC、GC（四）生物學(xué)法（一）化學(xué)法1、呈色反應(yīng)常用反應(yīng)類型：（1）酚羥基的三氯化鐵呈色反應(yīng)（2）羧酸衍生物的異羥肟酸鐵反應(yīng)（3）脂肪氨基的茚三酮呈色反應(yīng)（4）芳伯氨基的重氮化-偶合呈色反應(yīng)

Ar-NH2+HNO2Ar-N2Cl Ar-N2-Ar’

HCl 1-萘胺低溫 β-萘酚RCOOR’+NH2OHRCO-NHOH（異羥肟酸）OH-FeCl3紅色配合物H+2、沉淀反應(yīng)（1）游離沉淀反應(yīng)例：青霉素鉀（鈉）青霉素(白色↓)（2）與重金屬離子生成沉淀重金屬離子的概念：在pH3.5的酸度條件下能與S2-離子形成不同顏色的沉淀的金屬離子，如：鉛、汞、銀、銅、鎘、錫、銻、鉍等。（3）生物堿及氮雜環(huán)類藥物的沉淀反應(yīng)生物堿試劑：重金屬鹽類、大分子酸類重金屬鹽類：KBiI4、K2HgI4、I2-KI、HgCl2等；大分子酸類：硅鎢酸、磷鉬酸、苦味酸、鞣酸、磺基水楊酸等。注意：并非生物堿專效試劑稀HCl3、氣體生成反應(yīng)（1）生成氨（或胺）氣胺（銨）類、酰脲類、酰胺類在堿性介質(zhì)中游離出胺，加熱有胺的特殊氣味。如：抗癲癇藥撲米酮，環(huán)酰亞胺的結(jié)構(gòu)，藥典（2010版）二部：取本品0.1g，加無水碳酸鈉0.1g混合后，加熱灼燒，即有氨氣產(chǎn)生，能使?jié)駶櫟募t色石蕊試紙變?yōu)樗{(lán)色。（2）生成有刺激性特臭的SO2、H2S等含硫藥物，在強酸性條件下加熱產(chǎn)生（3）生成乙酸或乙酸乙酯乙酸酯或乙酸胺類藥物如阿司匹林，中國藥典（2010年版），【鑒別】（2）取本品約0.5g，加碳酸鈉試液10ml，煮沸2分鐘后，放冷，加過量的稀硫酸，即析出白色沉淀，并發(fā)生醋酸的臭氣。（4）產(chǎn)生紫色的碘蒸汽含碘的藥物，在一定條件下加熱產(chǎn)生。泛影酸，中國藥典（2010年版），【鑒別】（1）取本品約10mg，置坩堝中小火加熱，即產(chǎn)生紫色的碘蒸氣。4、焰色反應(yīng)用鹽酸濕潤的鉑絲蘸取供試品后在無色火焰中燃燒，使火焰呈現(xiàn)某種元素特異顏色的反應(yīng)。（二）光譜法1、紫外光譜法共軛結(jié)構(gòu)光譜特征參數(shù)：對比吸收光譜特征參數(shù)比較吸收度比值一致性對比吸收光譜一致性注意：電子光譜，特征性不是很強只適用于純物質(zhì)的鑒別2、紅外光譜法特點：分子的振動-轉(zhuǎn)動光譜，特征性強，是一種專屬性極強的鑒別手段。特別適合于化學(xué)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜或結(jié)構(gòu)差異較小的藥品鑒別。方法：對比供試品紅外吸收光譜與藥品標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜的一致性，尤其是指紋一致性。例：醋酸氫化可的松、氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照法《中國藥典藥品紅外光譜集》USP對照品比較法注意：只適用于純物質(zhì)的鑒別3、熒光法特點：專屬性很強方法：直接、間接例：維生素B1的鑒別——硫色素反應(yīng)維生素B1加酸熒光消失，加堿熒光又出現(xiàn)。加酸熒光消失，加堿熒光又出現(xiàn)（三）色譜法TLC、HPLC、GC對照品比較法保留值優(yōu)點：對復(fù)雜樣品具有分離能力，是各類鑒別試驗方法中專屬性較強的方法之一。注意：若某藥品標(biāo)準(zhǔn)已在有關(guān)物質(zhì)檢查或含量測定項下采用了HPLC法，則可同時采用HPLC法進(jìn)行鑒別。有時需同時制備陰性對照品，即不含待檢藥材或成分的供試品。避免共存組分引起的假陽性。

四）生物學(xué)法利用微生物或動物進(jìn)行鑒別試驗的方法一般多用于抗生素及生化藥物優(yōu)點：專屬、靈敏缺點：操作煩瑣、耗時較長。例：青霉素，從2005版開始該項鑒別試驗已被簡便快速的且同樣專屬性強的HPLC鑒別法代替。鑒別常用方法化學(xué)反應(yīng)、UV、IR、色譜法收載原則：專屬性強、重現(xiàn)性好、靈敏度高，操作簡便、快速，符合環(huán)保要求。原料藥：3-5個鑒別項目，一般IR必不可少，兼顧功能團(tuán)的化學(xué)鑒別和光譜及色譜鑒別。例：三唑侖26、阿苯達(dá)唑393化學(xué)藥物制劑：1-3個鑒別項目，功能團(tuán)的化學(xué)鑒別和光譜及色譜鑒別。例:阿司匹林片385中藥及其制劑：一般TLC必不可少,凡有原粉入藥者應(yīng)做顯微鑒別，兼顧理化方法.例：人工牛黃5、金銀花205、六味地黃丸5975.2.4鑒別試驗的靈敏度1、表示方法檢測限：最低檢出量（μg）、最低檢出濃度2、空白試驗blanktest一般：特殊：供試品也加，不加某一試劑。3、提高反應(yīng)靈敏度的方法（1）濃集產(chǎn)物（2）改進(jìn)觀測方法5.3雜質(zhì)檢查

對生產(chǎn)或儲存過程中可能產(chǎn)生或摻入的雜質(zhì)進(jìn)行檢查，以判斷樣品的純度是否符合要求。又稱純度檢查。1、雜質(zhì)的概念（1）有毒副作用的物質(zhì)。（2）本身無毒副作用，但影響藥物的穩(wěn)定性和療效。（3）本身無毒副作用，也不影響藥物的穩(wěn)定性和療效，但影響藥物的科學(xué)管理的物質(zhì)5.3.2雜質(zhì)的來源1、生產(chǎn)過程中引入（1）由起始原料引入（2）由合成或提取分離過程引入（3）由制劑過程產(chǎn)生例：鹽酸普魯卡因注射液（對氨基苯甲酸酯）對氨基苯甲酸（4）由生產(chǎn)裝置引入2、貯藏過程中產(chǎn)生水解、氧化、分解、異構(gòu)化、晶形轉(zhuǎn)變、聚合、潮解和發(fā)霉等。易發(fā)生水解反應(yīng)的結(jié)構(gòu)：酯、內(nèi)酯、酰胺、鹵代烴、苷類等在酸堿或高溫下水解反應(yīng)更容易發(fā)生如：阿司匹林原料藥和各種制劑均要求檢查游離水楊酸易發(fā)生氧化反應(yīng)的結(jié)構(gòu)：酚羥基、巰基、亞硝基、醛、長鏈共軛雙鍵等如：地蒽酚（黃）→二羥基蒽醌（棕）ChP：紫外光譜法5.3.4雜質(zhì)的限量檢查方法1、雜質(zhì)限量在不影響藥物療效和保證用藥安全的前提下，藥物中允許雜質(zhì)存在的最大量，通常用百分之幾或百萬分之幾（ppm）來表示。氯化物、硫酸鹽：0.002%~0.01%重金屬：10ppm砷鹽：1ppm

雜質(zhì)限量的制定原則：（1）雜質(zhì)本身的性質(zhì)（2）生產(chǎn)的可行性及分析檢測能力2、雜質(zhì)的限量檢查限量檢查：檢查所含雜質(zhì)是否超過雜質(zhì)限量的規(guī)定，通常不要求測定其準(zhǔn)確含量。(1)對照法注意：平行原則特點：需要對照品(雜質(zhì)、主成分自身對照)(2)靈敏度法在供試品溶液中加入試劑，在一定反應(yīng)條件下，不得有正反應(yīng)出現(xiàn)。特點：不需雜質(zhì)對照品例如：氯化鈉中鈣鹽和鋇鹽的檢查1011(3)測定法測定吸收度、pH值等。特點：不需對照品例如：腎上腺素中酮體的檢查4593、雜質(zhì)限量的計算腎上腺素中酮體的檢查：取本品，加鹽酸溶液（9→2000）制成每1ml中含2.0mg的溶液，照紫外-可見分光光度法（附錄IVA），在310nm的波長處測定，吸光度不得過0.05已知酮體的吸收系數(shù)=453，求酮體的限量？97：71．檢查某藥物中的砷鹽，取標(biāo)準(zhǔn)砷溶液2ml（每1ml相當(dāng)于1g的As）制備標(biāo)準(zhǔn)砷斑，砷鹽限量為0.0001％，應(yīng)取供試品的量為A.0.20gB.2.0gC.0.020gD.1.0gE.0.10g已知:c＝1g/ml＝1×106g/ml，V＝2ml,L＝0.0001%96：79．檢查維生素C中的重金屬時，若取樣量為1.0g，要求含重金屬不得過百萬分之十，問應(yīng)吸取標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液（每1ml＝0.01mg的Pb）多少ml？A.0.2mlB.0.4mlC．2mlD.1mlE.20ml5.3.5一般雜質(zhì)檢查1、檢查項目⑴氯化物檢查法 ⑵硫酸鹽檢查法⑶鐵鹽檢查法 ⑷重金屬檢查法⑸砷鹽檢查法 ⑹熾灼殘渣檢查法⑺溶液顏色檢查法 ⑻易炭化物檢查法⑼澄清度檢查法 ⑽干燥失重測定法⑾有機溶劑殘留量測定法2、注意事項《藥品檢驗操作標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定：（1）遵循平行操作原則①儀器的配對性如納氏比色管應(yīng)配對，刻度線高低相差不超過2mm②對照品與供試品的同步操作（2）正確的比色、比濁方法（3）溶液如不澄清，應(yīng)濾過。（4）若供試品有色，需經(jīng)消色處理后方可檢查。外消色法如高錳酸鉀中氯化物的檢查，可先加乙醇適量，使其還原褪色后再依法檢查。內(nèi)消色法5.3.6特殊雜質(zhì)檢查

（一）物理法嗅、味、揮發(fā)性、顏色、溶解性及旋光性等的差異。例：硫酸阿托品(消旋體)莨菪堿(左旋體)-0.4°（二）化學(xué)法1、酸堿性差異例：苯巴比妥巴比妥酸甲基橙2、氧化還原性差異例：氯化鈉中的碘化物淀粉混合液葡萄糖酸亞鐵中高鐵鹽的檢查滴定法3、呈色反應(yīng)雜質(zhì)特有的呈色反應(yīng)例：阿司匹林中檢查游離水楊酸4、沉淀反應(yīng)例：甘露醇、枸櫞酸鉀等藥物中的草酸鹽5、雜質(zhì)與一定試劑產(chǎn)生氣體例：微量硫化物的檢查醋酸鉛試紙三）光譜法1、紫外-可見分光光度法與比色法的區(qū)別2、熒光法3、紅外光譜法主要用于藥物中無效或低效晶型的檢查（四）色譜法TLC、HPLC、GC（1）雜質(zhì)對照品比較法（2）自身對照法未知雜質(zhì)或無雜質(zhì)對照品5.4含量測定方法選擇原則：根據(jù)被測組分含量高低、共存組分的干擾情況1、化學(xué)原料藥側(cè)重方法的準(zhǔn)確性首選容量分析法2、化學(xué)藥物制劑紫外分光光度法、HPLC、容量分析法3、中藥材及其成方制劑側(cè)重方法的專屬性和靈敏度HPLC、GC1、含量測定原料藥的含量測定：首選非水酸量法，準(zhǔn)確度高。苯溴馬隆制劑的含量測定：若賦形劑不干擾：紫外分光光度法。賦形劑干擾：高效液相色譜法或比色法（三氯化鐵顯色后的可見分光光度法）。2、鑒別原料藥的鑒別：三氯化鐵顯色制劑的鑒別：薄層色譜法3、雜質(zhì)檢查薄層色譜法，高效液相色譜法5.5分析方法驗證驗證項目一、準(zhǔn)確度二、精密度三、專屬性四、檢測限五、定量限六、線性七、范圍八、耐用性九、系統(tǒng)適用性試驗

一、準(zhǔn)確度1、概念分析方法的測定結(jié)果與真實值或參考值的接近程度凡是定量測定的項目一般都要考察準(zhǔn)確度。2、準(zhǔn)確度的考察和表示方法至少用9個測定結(jié)果進(jìn)行評價，報告已知加入量的回收率（%）或與標(biāo)準(zhǔn)方法的測定結(jié)果對比。原料藥的含量測定2制劑的含量測定3雜質(zhì)的定量測定23、對回收率的要求98％～102％如高效液相色譜法、氣相色譜法和紫外分光光度法等。注意：同時精密度要符合要求二、精密度1、概念在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。平行測定2、表示用至少9次測定結(jié)果進(jìn)行評價，或取測定濃度的供試液，用至少測定6次的結(jié)果進(jìn)行評價。報告標(biāo)準(zhǔn)偏差SD或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。3、精密度考察的三個層次（1）重復(fù)性在相同條件下，由同一分析人員測定所得結(jié)果的精密度。（2）中間精密度在同一實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果的精密度?？疾祀S機變動因素對精密度的影響。（3）重現(xiàn)性在不同實驗室由不同分析人員測定結(jié)果的精密度。法定標(biāo)準(zhǔn)采用的分析方法，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗。4、對精密度數(shù)值的具體要求（1）滴定分析和重量分析，RSD<0.5％；（2）可見-紫外分光光度法和原子吸收分光光度法，RSD<1.5％；（3）高效液相色譜法和氣相色譜法RSD<2％，薄層色譜法RSD<4％。（4）體內(nèi)藥物分析，大多數(shù)報道的色譜方法的RSD為5％～10％，（5）放射免疫測定(RIA)法,RSD可以適當(dāng)放寬至20％～25％。三、專屬性1、概念在其他成分（如雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在下，采用的方法能夠正確測定出被測物的特性。各種分析方法都應(yīng)考察專屬性2、色譜法專屬性的考察分離度應(yīng)符合要求；給出代表性圖譜，標(biāo)注諸成分的位置，以證實其專屬性；必要時進(jìn)行色譜峰純度檢查，以證明被分析物色譜峰中不包含其他成分。采用二極管陣列檢測器或質(zhì)譜檢測四、檢測限1、概念供試品中被分析物能被檢測出來的最低量。注意：不一定要準(zhǔn)確定量?？疾旆椒ㄊ欠窬邆潇`敏的檢測能力。鑒別試驗和雜質(zhì)的檢查方法，均應(yīng)通過測試確定方法的檢測限。2、考察方法（1）非儀器分析目視法（2）信噪比法適用于能顯示基線噪聲的儀器分析方法，如HPLC.一般以信噪比(S/N)為3/1或2/1時相應(yīng)的被分析物的量確定檢測限，應(yīng)附測試圖譜，并說明測試過程五、定量限1、概念供試品中被分析物能夠被定量測定的最低量。注意：應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確