第三章 基因的保持：DNA復制與損傷修復

基因的保持Genemaintenance第三章DNA復制與損傷修復ReplicationandRepairofDNA第一節(jié)DNA復制(DNAReplication)一、DNA復制概述二、DNA復制相關物質(zhì)三、DNA復制的起點、方向和速度四、半不連續(xù)復制五、DNA的復制過程（大腸桿菌為例）六、DNA復制的其它方式七、真核生物中DNA的復制特點八、DNA復制的調(diào)控（自學）主要內(nèi)容一、

DNA復制概述DNA的復制：以親代DNA分子為模板合成子代DNA鏈的過程。DNA復制可能的三種方式半保留全保留彌散型親代DNA子代DNADNA的半保留復制（semi-conservativereplication）以親代DNA雙鏈為模板以堿基互補方式合成子代DNA，在新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復制方式叫半保留復制。中國科學院上海生化與細胞所2002年招收碩士研究生分子遺傳學入學考試：請設計一個實驗來證明DNA復制是以半保留方式進行的（8分）。半保留復制的實驗證據(jù)

（1958）MatthewMesselsonFranklinStahlMeselson和Stahl將同位素15N標記的15NH4Cl加入大腸桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15代，使大腸桿菌的DNA都帶上15N的標記，然后將該大腸桿菌轉(zhuǎn)入14N的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，分離子代DNA,進行氯化銫密度梯度離心。半保留復制的實驗設計DNA復制可能的三種方式以及Meselson和Stahl實驗的可能結(jié)果半保留全保留彌散型15N14N0代1代半保留全保留彌散型15N14N0代1代2代Meselson和Stahl實驗的實際結(jié)果二、與DNA復制有關的物質(zhì)1、原料：四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)dATP,dGTP,dCTP,dTTP2、模板：親代的兩條DNA鏈3、引物：DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物4、引物酶（Primase）：此酶以DNA為模板合成一段RNA，這段RNA作為合成DNA的引物（Primer)。實質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。5、DNA聚合酶(DNAPolymerase)：以DNA為模板的DNA合成酶。以dNTP為底物;都需要Mg2+激活;反應需要有模板的指導;

反應需要有3-OH存在;DNA鏈的合成方向為53;DNA聚合酶的共同點：原核生物中的DNA聚合酶(大腸桿菌）DNApolIII的聚合和校對真核生物中的DNA聚合酶

（哺乳動物）DNA聚合酶α主要參與引物合成。DNA聚合酶β活性水平穩(wěn)定，主要在DNA損傷的修復中起作用。DNA聚合酶γ是主要負責線粒體DNA復制的酶。DNA聚合酶ε的主要功能可能是在去掉RNA引物后把缺口補全。DNA聚合酶δ是主要負責DNA復制的酶。6、DNA連接酶(DNAligase)：

催化雙鏈DNA切口處的3-OH和5-磷酸基生成磷酸二酯鍵，完成鏈與鏈之間的連接。但是它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來。3535OHP7、DNA拓撲異構酶(DNATopisomerase)：DNA復制過程中，使DNA螺旋結(jié)構保持松弛狀態(tài)，避免產(chǎn)生拓撲結(jié)構，保證復制的正常進行。拓撲異構酶?：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關。

拓撲異構酶Π：該酶能暫時性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負超螺旋引入DNA分子。同復制有關。II型DNA拓撲異構酶的作用機制I型DNA拓撲異構酶的作用機理

上海生化所1998年分子遺傳學試題：拓撲異構酶8、DNA解螺旋酶/解鏈酶（DNAhelicase)促進DNA兩條鏈分開的酶;可以和單鏈DNA結(jié)合，并且與ATP結(jié)合，通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。9、單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSBP)：DNA復制過程中時，與DNA單鏈相結(jié)合的蛋白。其主要功能是避免單鏈退火形成鏈內(nèi)氫鍵及保護單鏈不被降解。SSB與DNA結(jié)合時無序列專一性；SSB可加強DNA聚合酶對單鏈DNA的親和力；與其有關復制的酶如螺旋酶作用，或促進它們發(fā)揮自身作用。鏈內(nèi)氫鍵三、DNA復制的起點、方向和速度原核生物：一個復制起始位點。

例如：E.coli：oriC，全長245bp，該序列在所有細菌復制起始位點中都是保守的。

真核生物：DNA的復制是從許多起始點同時開始的。復制起點（origin）：DNA復制都是從某一特定位點開始，這一位點稱為復制起點，通常用ori表示。復制子（Replicon）：從復制起點到終點，組成一個復制單位。一個復制子只含一個復制起點。所有的原核生物的染色體、噬菌體僅有一個復制子；真核生物的染色體有多個復制子，哺乳動物細胞含有50,000-100,000個，每個復制子約長50-200kb。部分生物復制子的比較復制叉（Replicationfork）：復制時，解鏈酶等先將DNA的一段雙鏈解開，形成復制點，這個復制點的形狀象一個叉子，故稱為復制叉。復制方向和速度復制方向可以單向進行，也可雙向進行，這取決于在復制起始點有一個還是兩個復制叉。雙向等速！無論是原核生物還是真核生物，DNA的復制主要是從固定的起始點以雙向等速復制方式進行的。復制叉以DNA分子上某一特定順序為起點，向兩個方向等速生長前進。？由于DNA雙螺旋的兩條鏈是反向平行的，因此在復制叉附近解開的DNA鏈一條是5’→3’方向，另一條是3’→5’方向，兩個模板極性不同。而所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5’→3’，兩條鏈無法同時進行復制。？5′3′四、半不連續(xù)復制

（Semi-discontinuousreplication）1968年，日本學者岡崎（Okazaki）等提出了DNA的半不連續(xù)復制模型。定義：DNA在復制過程中，一條鏈是連續(xù)合成的，而另一條鏈合成是不連續(xù)的，這樣的復制過程稱為半不連續(xù)復制。前導鏈(leadingstrand)：以復制叉向前移動的方向為標準，合成方向與復制叉移動的方向一致并連續(xù)合成的鏈為前導鏈。后隨鏈(laggingstrand)：與復制叉移動方向相反，隨著復制叉的移動，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連接成一條完整的DNA鏈，稱為后隨鏈。岡崎片段（Okazakifragment）：在DNA復制過程中，由后隨鏈斷續(xù)合成的、53的不連續(xù)的小片段稱為岡崎片段。DNA的半不連續(xù)復制前導鏈的連續(xù)復制和滯后鏈的不連續(xù)復制在生物界是有普遍性五、DNA的復制過程

（大腸桿菌為例）復制的起始1、起始復合物/引發(fā)體的形成2、RNA引物的合成3、復制體的組裝新鏈的延伸復制的終止大腸桿菌基因組以雙鏈環(huán)狀DNA分子的形式存在，其DNA復制的中間產(chǎn)物可形成一個θ，復制從定點開始雙向等速進行

(θ型復制)

。(一)復制起點顯著特點：富含A-T

復制原點是oriC，包括245bp的序列，由9bp和13bp重復序列組成。(二)復制的起始1、起始復合物/引發(fā)體的形成①

拓撲異構酶II將負超螺旋引入DNA分子，解開超螺旋。②大約20個起始蛋白DnaA在ATP的作用下與oriC處的4個9bp保守序列相結(jié)合，形成起始復合物。促進DNA解旋或者使臨近的DNA發(fā)生扭曲，使DNA解鏈酶進入。幫助其他與復制叉組裝的相關因子進入。③在類組蛋白（HU）和ATP參與下,DanA蛋白使3個13bp直接重復序列變性，形成開鏈復合物。④借助于水解ATP產(chǎn)生的能量和在DnaC的幫助下，解鏈酶DnaB六體分別與兩條單鏈DNA相結(jié)合，進一步解開DNA雙鏈。⑤

SSB蛋白四聚體結(jié)合到單鏈上，形成預引發(fā)復合物/預引發(fā)體。

⑥引物酶DnaG加入形成引發(fā)體。2、RNA引物的合成DnaB蛋白活化引物酶DnaG，引發(fā)RNA引物的合成。引物長度：10nt左右。2002年上海生化與細胞所基因組DNA復制時，先導鏈的引物是DNA，后隨鏈的引物是RNA()3、復制體的組裝DNA聚合酶III組裝到引發(fā)的DNA上完成復制體的組裝。起始復合物開鏈復合物預引發(fā)體引發(fā)體復制體(三)新鏈的延伸DNA聚合酶III把新鏈的第一個核苷酸加到引物的3′-OH上，開始新鏈的延伸過程。1、前導鏈的合成①首先引物酶合成約10核苷酸大小的新引物。②DNApolymeraseIII以5′-3′方向延伸該新的引物。2、后隨鏈的合成（岡崎片段的合成）(b)首先引物酶合成約10核苷酸大小的新引物。兩個引物間的距離在細菌中約為1000-2000個核苷酸，在真核細胞中約為100-200個核苷酸。(c)DNApolymeraseIII以5′-3′方向延伸該新的引物，直到遇到鄰接引物的5′端。這個新合成的DNA片斷就是Okazakifragment。(d)

DNApolymeraseI去除引物。(e)

DNA連接酶連接相鄰的岡崎片斷。整個滯后鏈的合成重復步驟(b)到(e)。3、岡崎片段引物的切除、缺口的填補和切口的連接①

DNApolymeraseI具有5′-3′外切酶的活性。在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物。②DNApolymeraseI具有5′-3′聚合酶的活性。留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填補上。③在DNA連接酶作用下，連接相鄰的DNA鏈。4、協(xié)同復制機理

DNA聚合酶Ⅲ全酶的兩個催化核心分別與DNA的一條模板鏈結(jié)合。當全酶隨著復制叉沿前導鏈的合成方向移動時，后隨鏈的模板被甩出來，產(chǎn)生一個環(huán)。隨著復制叉的前進，這一環(huán)不斷擴大并向復制叉前進的方向回折，造成局部岡崎片段的合成相方向與前導鏈合成方向一致。這樣既保證了兩條鏈合成方向都是5′-3′，又保證了后隨鏈聚合酶移動方向能夠與復制叉移動的方向保持一致。E.Coli中DNA復制的延伸(四)復制的終止當復制叉前移，遇到20bp重復性終止子序列（Ter）時，Ter-Tus復合物能阻擋復制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復制叉到達后在DNA拓撲異構酶IV的作用下使復制叉解體，釋放子鏈DNA。1、鏈的終止需要Tus蛋白參與鏈的終止（Termination）E.coliDNA復制終止區(qū)的結(jié)構2、子代DNA的分離在DNA拓撲異構酶IV的作用下使復制叉解體，釋放子鏈DNA。六、DNA復制的其他方式復制的幾種主要方式線性DNA雙鏈的復制環(huán)狀DNA雙鏈的復制θ型滾環(huán)型(rollingcircle)D-環(huán)型(D-loop)1、環(huán)狀DNA雙鏈的復制-θ型細菌環(huán)狀染色體的雙向復制：兩個復制叉從起點開始以相反方向沿著染色體移動，在起點對面的中間點相遇并停止復制。如：ΦΧ174的雙鏈環(huán)狀DNA復制型（RF）2、滾環(huán)型(rollingcircle)正鏈合成不需RNA引物，在正鏈3′-OH上延伸。是一個連續(xù)的合成過程。復制起始于某一條DNA鏈上新生DNA鏈延伸，不斷取代母鏈復制一圈，產(chǎn)生單位長度的線性DNA鏈若復制繼續(xù)進行，可產(chǎn)生多單元線性DNA鏈正鏈的合成：Rollingcirclesproducemultimersofareplicon負鏈的合成：（1）單向復制的特殊方式；（2）模板鏈和新合成的鏈分開;（3）只有一個復制叉;滾環(huán)型復制的主要特點：是一個不連續(xù)的合成過程。3、D-環(huán)型(D-loop)Dloop復制方式首先在動物線粒體中被發(fā)現(xiàn)。一條短RNA與一條DNA互補，取代了該區(qū)域原來的互補的DNA鏈，使得兩條鏈的合成高度不對稱，一條鏈上迅速合成出互補鏈，另一條鏈則為游離的單環(huán)。兩條鏈的復制起點位置不同，且復制不同步。七、真核生物中DNA的復制特點1、真核生物染色體有多個復制起點，稱為自主復制序列（autonomouslyreplicatingsequences,ARS）或復制基因(replicator)；呈雙向復制，多復制子。長約150bp左右，包括數(shù)個復制起始必需的保守區(qū)。3、真核生物DNA復制速度比原核慢，速度約為

50bp/s(僅為原核生物的1/20~1/50）。2、岡崎片段比原核短，長約200bp(僅為原核生物的1/10）。4、真核生物染色體在全部復制完之前起點不再重新開始復制?？焖偕L時，往往采用更多的復制起點；而在快速生長的原核生物染色體DNA復制中，起點可以連續(xù)發(fā)動復制。5、真核生物有多種DNA聚合酶（已知15種）。基本性質(zhì)與原核相同，但一般都不具有5′-3′的外切酶活性。6、岡崎片段RNA引物的切除。RNaseH1和FEN1蛋白（5′-3′的外切酶活性）切除RNA引物，DNA聚合酶ε填補缺口，DNA連接酶進行連接反應。7、真核生物存在末端復制問題(End-replicationproblem)。DNA復制都需RNA引物的參與，其勢必占據(jù)滯后鏈末端的一段DNA序列而使之無法復制，這意味著在滯后鏈末端的一段DNA序列最終未被復制。這也就是所謂的末端復制問題（End-replicationproblem）。End-replicationproblem染色體末端結(jié)構與端粒酶端粒（Telomere）：真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構。生物學功能:維持染色體的穩(wěn)定性維持DNA復制的完整性端粒酶（Telomerase）：是一種RNA-蛋白質(zhì)復合物。其RNA序列?？膳c端粒區(qū)的重復序列互補；蛋白質(zhì)部分具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，因此能以其自身攜帶的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA。結(jié)構特點：富含G的短序列多次重復，重復可多達數(shù)十甚至上百次。Themechanismoftelomereextensionbytelomerase(b)端粒酶以自身的RNA為模板，在3′端合成DNA序列。(c)端粒酶完成一輪復制，發(fā)生移位，進行下一輪復制。(a)端粒酶中的RNA序列與端粒區(qū)的重復序列互補配對。ThemechanismoftelomereReplicationToextendthelengthofatelomere,thetelomerasefirstextendsitslongerstrand.Then,usingthesamemechanismassynthesizingthelaggingstrand,theshorterstrandisextended.8、真核生物復制過程中的核小體結(jié)構（1）組蛋白的合成在細胞核中與DNA復制同步進行；（2）組蛋白八聚體以全保留方式傳給子代，即親代八聚體全部分布在子代一條鏈上，另一條鏈八聚體為新合成的。原核生物和真核生物DNA復制的比較相同點：1.Semi-conservativereplication2.Semi-discontinuousrepliction3.DNAhelicase,SSB4.RNApriming5.校正閱讀（Proofreading）不同點：1.復制起點（單、多）2.復制子（大小、多少）3.復制周期的重疊與否4.復制速度(900/50nt/s)5.岡崎片段的大小6.端粒和端粒酶DNA聚合酶Polymerases核小體第二節(jié)

DNA的損傷與修復(DNAMutation&Repair)一、DNA的損傷（DNAMutation）1、DNA損傷的概念生物體生命過程中，由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA雙螺旋結(jié)構發(fā)生的任何改變，都稱之為DNA損傷。2、DNA損傷的因素自發(fā)性損傷

DNA復制中的損傷DNA的自發(fā)性化學變化（堿基互變異構、自發(fā)脫氨基、脫嘌呤和脫嘧啶）細胞的代謝產(chǎn)物對DNA的損傷（氧化損傷）物理因素引起的DNA損傷(電離輻射、紫外線)化學因素引起的損傷（烷化劑、堿基類似物）3、DNA損傷的主要類型堿基脫落、堿基（或核苷）改變、錯誤堿基（堿基的取代）、堿基的插入或缺失、鏈的斷裂、鏈交聯(lián)（鏈內(nèi)、鏈間）、嘧啶二聚體等等。由于染色體DNA在生命過程中占有至高無上的地位，DNA復制的準確性以及DNA日常保養(yǎng)中的損傷修復就有著特別重要的意義。二、DNA的修復（DNARepair）DNA修復（DNArepair）是細胞對DNA受損傷后的一種反應。這種反應可能使DNA結(jié)構恢復原樣，重新能執(zhí)行它原來的功能；但有時并非能完全消除DNA的損傷，只是使細胞能夠耐受這DNA的損傷而能繼續(xù)生存。對DNA的修復機理進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)在生物體內(nèi)存在多種修復途徑，如能糾正復制錯誤的錯配修復系統(tǒng)，以及能修復環(huán)境因素和體內(nèi)化學物質(zhì)造成DNA分子損傷的直接修復系統(tǒng)、切除修復系統(tǒng)、重組修復系統(tǒng)和SOS修復系統(tǒng)等。DNA分子的雙螺旋結(jié)構是其損傷修復的重要基礎，因為DNA的互補雙鏈可保證其一股鏈上的損傷被切除后，能從另一股鏈上獲得修復所需要的信息。大腸桿菌中DNA的修復系統(tǒng)1、錯配修復（mismatchrepair）

糾正復制錯誤的修復體系；按照“保證母鏈，修正子鏈”的原則進行修復；識別的依據(jù)是DNA雙鏈的甲基化狀態(tài)；

Dam甲基化酶：對DNA模板鏈的5′-GATC序列中腺嘌呤的N6位置進行甲基化修飾。當復制完成后，在短暫的時間內(nèi)（幾秒或幾分鐘），只有模板鏈是甲基化的，而新合成的子鏈是非甲基化的。對存在于GATC序列附近的復制錯配按親代鏈的信息進行修復錯配修復系統(tǒng)主要包括mutH、mutL、nutS基因的產(chǎn)物。錯配修復機理mutL,mutS和mutH識別錯配堿基在未甲基化的新生子代鏈上產(chǎn)生切口在DNA聚合酶和連接酶的作用下合成新的子鏈片段新合成鏈也將在Dam甲基化酶作用下被甲基

化，從而成為全甲基化DNA2、切除修復（ExcisionRepair）當DNA的兩條鏈中有一條受損傷，可將損傷部分切除，根據(jù)互補鏈的序列對其進行修復。切除修復是修復DNA損傷最為普遍的方式，對多種DNA損傷包括堿基脫落形成的無堿基位點、嘧啶二聚體、堿基烷基化、單鏈斷裂等都能起修復作用。①核苷酸切除修復

(Nucleotide-ExcisionRepair,NER)當DNA一條鏈上的核苷酸發(fā)生損傷，導致相應位置雙鏈之間無法形成氫鍵，則由核苷酸切除修復系統(tǒng)負責修復。NER的關鍵特征是對損傷的DNA鏈兩端進行切割，修復補丁的大小在真核生物為25-30nt，原核生物如大腸桿菌為12nt。DNARepairbynucleotideexcision損傷發(fā)生后，首先由DNA切割酶在已損傷的核苷酸5′和3′位分別切開磷酸糖苷鍵，產(chǎn)生并移去DNA小片段，然后由DNA聚合酶合成新片段，并由DNA連接酶完成修復中的最后步驟。②堿基切除修復

(Base-ExcisionRepair,BER)BER可以去除因脫氨基、脫嘌呤、脫嘧啶或堿基丟失等因素產(chǎn)生的DNA損傷。

DNA糖基化酶（gylcosylases）

水解受損堿基和脫氧核糖-磷酸鹽鏈間的N-糖苷鍵，從而將非正常堿基從脫氧核糖上切除。去堿基后的核苷酸被稱為去嘌呤或（apurinic）去嘧啶（apyrimidinic）位點，統(tǒng)稱為AP位點。DNArepairbybaseexcisionDNA分子中一旦產(chǎn)生了AP位點，內(nèi)切酶就會移去AP位點附近的一小段DNA，并由DNA聚合酶和DNA連接酶共