第11章 基因工程新技術(shù)

第11章基因工程新技術(shù)1.λRed和RecET重組系統(tǒng)及其應(yīng)用

2.位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)及其應(yīng)用

3.基因打靶

4.基因抑制技術(shù)

早在1990s,研究者發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母等真菌中具有高效的同源重組系統(tǒng)，僅需要20~40bp長(zhǎng)的同源區(qū)即可發(fā)生重組?？梢苑奖愕睦肞CR產(chǎn)物進(jìn)行基因打靶或替換。細(xì)菌的同源重組頻率較低，且需要較長(zhǎng)的同源區(qū)段.1.λRed和RecET重組系統(tǒng)及其應(yīng)用E.coli

自身的同源重組系統(tǒng)主要包括：RecBCD,RecE,RecF系統(tǒng)，其重組效率均較低，且對(duì)同源區(qū)要求為：1–2kb。最主要的重組系統(tǒng)RecBCD在

dsDNA同源區(qū)為50–100kb(通過(guò)接合轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)導(dǎo))

，才能高效重組。經(jīng)修飾過(guò)的RecBCD及RecA系統(tǒng)能在Chi位點(diǎn)(crossoverhotspotinstigator,GCTGGTGG)高效重組，同源區(qū)段長(zhǎng)度一般不低于5kb，重組需要DNA片段兩端有同向的CHI位點(diǎn)。如果人工構(gòu)建這樣的片段，其重組幾率為10-51998年左右，隨著對(duì)λ噬菌體重組系統(tǒng)的深入研究，發(fā)現(xiàn)該重組系統(tǒng)可以在E.coli中實(shí)現(xiàn)高效同源重組，且同源區(qū)長(zhǎng)度要求極低：約40bp。后來(lái)，在Rac噬菌體中發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的重組系統(tǒng)。隨著該技術(shù)的應(yīng)用，出現(xiàn)了一個(gè)新的術(shù)語(yǔ)：Recombineering(recombination-mediatedgeneticengineering)isageneticandmolecularbiologytechniquebasedonhomologousrecombinationsystemsinE.coliandotherbacteriamediatedbyphageproteins,eitherRecE/TfromRacprophageorRedalpha/beta/gammafrombacteriophagelambdaλRed/ETrecombinationsystemsarehighlightedbytheirabilitytocrossPCR-generatedsubstratesbearingsmallregionsofhomologytothetargetgene(40–50bp)intobacterialchromosomes,allowingbacterialgeneticiststoperformPCR-mediatedgenereplacement(1)λRed系統(tǒng)

及rac噬菌體的RecET系統(tǒng)的原理Red系統(tǒng)包括3個(gè)基因:exo,bet

和gamexo

基因編碼λ核酸外切酶，其活性形式是一種環(huán)狀三聚物分子,中間有一中空的通道,通道的一端可容納雙鏈DNA分子,另一端只可容納單鏈DNA。Exo蛋白可結(jié)合在雙鏈DNA的末端,從DNA雙鏈的5′端向3′端降解DNA,產(chǎn)生3′突出端。(RecE)Beta蛋白是一種退火蛋白,自發(fā)地形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)(12–18subunitsperring),,緊緊地結(jié)合在單鏈DNA3′突出端,防止DNA被單鏈核酸酶降解,同時(shí)介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA的退火,雙鏈DNA退火完成后,Beta蛋白從DNA雙鏈上解離下來(lái)。Beta蛋白在Red同源重組過(guò)程中起著決定性的作(RecT)

Gam蛋白可與RecBCD結(jié)合,抑制其核酸外切酶活性，防止對(duì)外源DNA的降解。宿主菌用recBCD缺陷株有利于該系統(tǒng)的高效重組。λRed系統(tǒng)的重組效率約比RecET系統(tǒng)高3倍?！?2)主要應(yīng)用需要輔助質(zhì)粒，上面帶有誘導(dǎo)表達(dá)的重組系統(tǒng)。為避免本底表達(dá)對(duì)細(xì)胞的影響（毒性、誘變等效應(yīng)），輔助質(zhì)粒多為溫敏性質(zhì)粒，可在高溫下被消除。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增誘導(dǎo)培養(yǎng)含pKD46大腸桿菌轉(zhuǎn)化PCR片段，培養(yǎng)2h后涂布抗性平板，高溫培養(yǎng)I基因敲除及markerfree操作（需結(jié)合位點(diǎn)特異性重組技術(shù)）II結(jié)合反向篩選進(jìn)行基因替換正向篩選：含有標(biāo)記基因的克隆在篩選平板上長(zhǎng)出，不含標(biāo)記基因則死亡。反向篩選：也稱(chēng)為負(fù)篩選，含有標(biāo)記基因的克隆死亡，不含標(biāo)記基因的克隆正常生長(zhǎng)catsacBgeneAgeneAMutantcatsacBcatsacBgeneAMutantStep1Step2例：cat正篩選標(biāo)記，sacB負(fù)篩選標(biāo)記chloramphenicolMediumsucrose重疊延伸PCR基因敲除catsacBgeneAgeneAcatsacBcatsacBgeneAStep1Step2Geneinversion（smallfragment)III介導(dǎo)單鏈DAN重組，進(jìn)行基因修飾如果向細(xì)胞中導(dǎo)入ssDNA(DNAoligo),則不需要Exo蛋白就能夠與同源區(qū)退火，實(shí)際上，Bet單獨(dú)作用可以使70-basessDNAoligo(SSO)與染色體的同源區(qū)退火互補(bǔ)而發(fā)生重組，其頻率約2×105/108,比dsDNA略高。如果存在Gam蛋白，則重組效率可提高(5-fold）.40–60bp單鏈的重組效率下降5倍。另外，和滯后鏈重組的效率高于前導(dǎo)鏈。由于不能插入標(biāo)記基因，使得其只能應(yīng)用于具有明顯表型特征的基因修飾。

改進(jìn)：

MMR(specifcallyremovetheoligo-directedbasechange)系統(tǒng)缺陷株中，重組效率會(huì)提高2個(gè)數(shù)量級(jí)，可高達(dá)25%！這意味著不再需要標(biāo)記基因，可以進(jìn)行數(shù)個(gè)堿基的替換、插入或缺失。mutS:Methyl-directedMismatchRepair重大改進(jìn)：MAGE技術(shù)（MultiplexAutomatedGenomeEngineering）1.多種ssDNA并行重組，同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)修飾。2.多輪循環(huán)重組，提高多位點(diǎn)修飾的幾率3.適于高通量的隨機(jī)優(yōu)化缺點(diǎn)：對(duì)于多位點(diǎn)隨機(jī)優(yōu)化，需要高通量篩選技術(shù)，或具有明顯的表型特征只能進(jìn)行短序列的修飾（如RBS位點(diǎn)）ProgrammingcellsbymultiplexgenomeengineeringandacceleratedevolutionNature

460,894-898markermarker2IV染色體大片段復(fù)制

復(fù)制染色體上的基因：加入PCR產(chǎn)物，引物設(shè)計(jì)時(shí)上游引物與目標(biāo)基因下游序列同源，下游引物與目標(biāo)基因上游序列同源，第一次重組造成染色體斷裂，第二次重組一條染色體修復(fù)，并造成目標(biāo)基因多一個(gè)拷貝。

引物設(shè)計(jì)時(shí)加入同向排列的特異性位點(diǎn)，可彈出MARKER

應(yīng)用該技術(shù)可復(fù)制長(zhǎng)達(dá)1Mbp的序列。2.位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)及其應(yīng)用位點(diǎn)特異性重組重組發(fā)生在特殊位點(diǎn)上，此位點(diǎn)含有短的同源序列,供重組蛋白識(shí)別。

位點(diǎn)特異性重組與同源重組的區(qū)別

重組位點(diǎn)限制：有同源序列的長(zhǎng)短：短重組酶的專(zhuān)一性：有重組效率：高達(dá)100%常見(jiàn)的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)

λ噬菌體系統(tǒng)：λ噬菌體編碼λ整合酶（integrase，Int重組酶，不可逆）、來(lái)自E.coli的整合作用宿主因子（IHF，integrationhostfactor）、切除酶（excisionase）

P1噬菌體系統(tǒng):Cre重組酶（可逆）

2m質(zhì)粒系統(tǒng)：FLP重組酶（可逆）

鏈霉菌噬菌體C31系統(tǒng)（不可逆）均可廣泛應(yīng)用于真核細(xì)胞中兩邊為13bp反向重復(fù)序列，中間位8bp非對(duì)稱(chēng)核心序列（1）重組機(jī)理如果一個(gè)DNA分子上兩個(gè)特異位點(diǎn)之間發(fā)生重組，其后果有兩種可能性：兩個(gè)位點(diǎn)之間的片段或丟失，或被顛倒生物能夠利用這種重組倒置來(lái)控制基因的表達(dá)因?yàn)镈NA的一正一倒兩種排列法可以相應(yīng)地表達(dá)兩種不同的蛋白質(zhì)，細(xì)胞就可根據(jù)需要作出選擇。Cre重組酶催化位點(diǎn)：loxP位點(diǎn)loxPloxPloxPloxP當(dāng)基因組含有一個(gè)重組酶識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，轉(zhuǎn)入基因可以發(fā)生位點(diǎn)特異性整合，但必須解決整合的穩(wěn)定性問(wèn)題loxp位點(diǎn)的點(diǎn)突變Cre酶無(wú)法有效識(shí)別降低基因丟失幾率：突變點(diǎn)loxp位點(diǎn)的點(diǎn)突變Cre酶無(wú)法有效識(shí)別實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的基因顛倒：突變點(diǎn)或者采用類(lèi)似于λred系統(tǒng)的策略，重組酶基因在溫敏性輔助質(zhì)粒上誘導(dǎo)表達(dá)（2）主要應(yīng)用

I利用位點(diǎn)特異性重組控制轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)將一個(gè)序列置于目標(biāo)基因與其啟動(dòng)子之間（如轉(zhuǎn)錄終止單元＋loxP序列）阻遏基因的表達(dá)將cre基因置于誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制之下，控制Cre重組酶的表達(dá)，從而控制目標(biāo)基因的表達(dá)loxPloxPII條件缺失突變體的構(gòu)建在目標(biāo)基因的兩側(cè)引入特異性重組位點(diǎn)將cre基因置于誘導(dǎo)啟動(dòng)子或具有組織特異性的啟動(dòng)子控制之下，在某種條件下使Cre重組酶表達(dá)，從而缺失目標(biāo)基因優(yōu)點(diǎn)：同源重組造成“完全的”基因敲除，而同源重組和位點(diǎn)特異性重組結(jié)合后可以對(duì)基因敲除進(jìn)行時(shí)間和空間上的控制，例如可以研究致死型基因在特殊發(fā)育階段的效應(yīng)、研究基因是否在某種組織中表達(dá)。要避免Cre重組酶的背景活性III利用位點(diǎn)特異性重組進(jìn)行染色體工程markermarkermarker1marker2FRT/loxPFRT/loxPFRT/loxPFRT/loxPFRT/loxPFRT/loxP位點(diǎn)特異性重組大腸桿菌中采用該方式一次性刪除117-165-kbp片段，效率100%Markerfree操作，但不屬于無(wú)痕操作，每次重組留下一個(gè)疤痕，造成極性效應(yīng)，多影響下游基因表達(dá)。多個(gè)疤痕對(duì)后續(xù)操作也有不利影響例：植物中染色體大片段的缺失gusA：編碼β-葡(萄)糖苷酸酶，報(bào)告基因Ds:植物轉(zhuǎn)座子

染色體大片段顛倒：兩個(gè)特異性位點(diǎn)反向排列，重組酶表達(dá)后，部分細(xì)胞的兩個(gè)位點(diǎn)之間序列顛倒。FRT/loxPFRT/loxPmarker1marker2marker1marker2基因融合tagsequenceloxP/FRTsequencegeneACterminalsequence(notranslationstopsignal)markergeneAmarkermolecularcloningfreeAsinglechromosomalFRTsitebecomesthesubstrateforrecombinationwithFRT-containingreplication-deficientplasmidsthatcarrieslacZandlacY,designedinsuchawaytocreateeitheratranscriptionalortranslationalfusiontothepromoterofinterest.3.基因打靶及無(wú)痕操作技術(shù)基因打靶：利用外源DNA與染色體DNA的同源性進(jìn)行同源重組，從而定點(diǎn)修飾改造染色體DNA的一類(lèi)技術(shù)。（1）主要方法單交換同源重組雙交換同源重組二次單交換同源重組（屬于無(wú)痕操作技術(shù)）其它無(wú)痕操縱技術(shù)I單交換同源重組法

利用整合性質(zhì)粒上與染色體DNA同源的區(qū)段進(jìn)行同源重組，通過(guò)整合性質(zhì)粒插入染色體來(lái)達(dá)到對(duì)染色體DNA的復(fù)制、失活、啟動(dòng)子替換等目的。原理圖：?jiǎn)?dòng)子+完整orfA:復(fù)制orfA的5’端或中間區(qū)域：失活orfA的3‘端區(qū)域：對(duì)基因A表達(dá)無(wú)影響，在染色體上多了一個(gè)不完整的orfA拷貝（缺5’端）誘導(dǎo)啟動(dòng)子+5‘端：實(shí)現(xiàn)A基因的啟動(dòng)子替換、構(gòu)建條件敲除株構(gòu)建整合質(zhì)粒：原啟動(dòng)子+orfA5’端與報(bào)告基因的融合片段（轉(zhuǎn)錄融合、翻譯融合均可）可以通過(guò)報(bào)告基因研究原啟動(dòng)子的表達(dá)規(guī)律，即基因A的表達(dá)規(guī)律對(duì)于高效短同源重組系統(tǒng)，可用兩端有短同源區(qū)的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行基因打靶（見(jiàn)red系統(tǒng)），省去克隆步驟。對(duì)于長(zhǎng)同源區(qū)重組系統(tǒng)，無(wú)法通過(guò)PCR引物引入同源區(qū)，需要經(jīng)過(guò)多次克隆構(gòu)建基因打靶質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行基因打靶II雙交換同源重組Marker2Marker2可實(shí)現(xiàn)基因敲除(B)及基因的異位整合表達(dá)(A)orfB白喉毒素A基因（DTPA)的負(fù)篩選作用：A亞基抑制蛋白合成，不需加篩選藥物，從而避免真核細(xì)胞的非同源重組整合neo基因的正篩選作用，對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素G418的抗性單純皰疹病毒胸苷激酶

(HSVTK)基因的負(fù)篩選作用，將丙氧鳥(niǎo)苷或非阿尿苷（FIAU）變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)，在含丙氧鳥(niǎo)苷或FIAU培養(yǎng)基中篩選基因?qū)ぐ匈|(zhì)粒Cre表達(dá)質(zhì)粒突變基因動(dòng)物基因打靶過(guò)程：P319圖14.1，若不需彈出篩選標(biāo)記見(jiàn)圖14.2III二次單交換同源重組（屬于無(wú)痕操作技術(shù)）通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)連接片段A和C，缺失B片段（數(shù)十~數(shù)百個(gè)密碼子序列），得到的AC片段的編碼產(chǎn)物缺失了部分氨基酸。如果將該AC片段替代染色體上ABC片段，即可實(shí)現(xiàn)基因打靶，而且是無(wú)痕操作，沒(méi)有任何多余的核苷酸殘留的染色體上。uppcatABCMCSblaACSinglecrossoverGrowthonMSMmediumcontaining20?M5FUCregionrecombinationAregionrecombinationABCACWildtypeMarkerlessBkonckoutStep3也可利用二次單交換同源重組進(jìn)行等位基因置換IV其它無(wú)痕操作技術(shù)Usingthismethod,Kolisnychenkoetal.deleted0.37MbofE.coliDNAconsistingofcrypticprophages,transposons,damagedgenesandgenesofunknownfunction.ThisstrainMDS12resultedina8.3%reductionofgenomecontentSceI+recA重組系統(tǒng)：設(shè)計(jì)PCR產(chǎn)物（含酶切位點(diǎn)red同源重組誘導(dǎo)SceI表達(dá)recA重組修復(fù)4.基因抑制技術(shù)4.1核酸水平的基因抑制

（1）反義核酸技術(shù)（2）共抑制（3）RNA干涉（4）核酶構(gòu)件

（1）反義核酸技術(shù)正義鏈反義鏈反義技術(shù)：根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，表達(dá)天然的或人工合成的與特定基因互補(bǔ)的反義核酸（RNA或DNA)片段，在胞內(nèi)形成雙鏈體，從而對(duì)特定基因的表達(dá)進(jìn)行抑制或封閉的技術(shù)。反義核酸是細(xì)胞中（主要在原核細(xì)胞中）天然存在的一種調(diào)節(jié)分子，可以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA剪切或修飾、蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程。

4.1核酸水平的基因抑制5335+-構(gòu)建反義基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入反義基因，持續(xù)穩(wěn)定地抑制基因表達(dá)?；蛘咧苯訉⒎戳x核酸片段導(dǎo)入細(xì)胞，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行短期干擾。

根據(jù)作用方式不同可將反義核酸技術(shù)分為3類(lèi)：①反義DNA技術(shù)：合成的反義寡脫氧核苷酸被攝入靶細(xì)胞并與靶mRNA結(jié)合，干擾mRNA的轉(zhuǎn)錄或阻斷蛋白翻譯；②反義RNA技術(shù)：將反義寡脫氧核苷酸序列連接到載體(病毒、質(zhì)粒上)導(dǎo)入靶細(xì)胞，載入的寡核苷酸轉(zhuǎn)錄出反義RNA，與靶mRNA交聯(lián)，封閉mRNA蛋白翻譯過(guò)程；（最主要的一類(lèi)）③核酶技術(shù)：核酶是一類(lèi)具有酶特性的RNA分子，通過(guò)催化靶位點(diǎn)RNA鏈中磷酸二酯鍵的斷裂，特異性地剪切底物RNA分子，從而阻斷基因的表達(dá)反義RNA的抑制效果與RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)有重要關(guān)系。在原核細(xì)胞中，反義RNA以針對(duì)SD序列效果最好，而在真核細(xì)胞中以5‘端非編碼區(qū)為標(biāo)靶最有效。主要作用機(jī)理有以下幾種：①mRNA5’端非翻譯區(qū)，包括sD序列或核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)；②mRNA5’端編碼區(qū)，主要是起始密碼AUG區(qū)域；③mRNA5’末端帽子形成位點(diǎn)區(qū)域,阻止mRNA的成熟及其向胞漿中的轉(zhuǎn)運(yùn)。④前體mRNA外顯子與內(nèi)含子結(jié)合部位,干擾剪切和拼接.⑤mRNApolyA形成位點(diǎn)區(qū)域，阻止mRNA的成熟，降低穩(wěn)定性⑥與其靶mRNA結(jié)合形成雜交鏈，容易使RNaseH等核酸酶降解mRNA

反義RNA技術(shù)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)操作簡(jiǎn)便，靶mRNA范圍廣安全性較好抑制基因表達(dá)的效率不穩(wěn)定穩(wěn)定性方面的改進(jìn)：對(duì)于直接導(dǎo)入細(xì)胞的反義核酸，可以使用氨基磷酸核苷酸、硫代磷酸核苷酸等經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的底物進(jìn)行合成，可以更好的抵抗核酸酶的破壞。另外需要增加核酸進(jìn)入細(xì)胞的能力，例如用脂質(zhì)體包裹、與多聚賴(lài)氨酸等連接對(duì)于體內(nèi)表達(dá)，可在反義DNA片段的5‘端、3’端加上多余的序列，形成5‘端、3’端的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，抵御核酸酶降解。（2）共抑制在宿主中導(dǎo)入單個(gè)或多個(gè)基因拷貝后引起轉(zhuǎn)入的基因表達(dá)受到抑制，若轉(zhuǎn)入基因在染色體上有同源基因，還可同時(shí)抑制染色體上同源基因的表達(dá)該現(xiàn)象首先在植物中發(fā)現(xiàn)，其機(jī)制非常復(fù)雜，可能和轉(zhuǎn)錄中及轉(zhuǎn)錄后的基因沉默有關(guān)，是植物抵抗外來(lái)核酸入侵（如病毒）的一種反應(yīng)

1990年，Napoli等為了加深牽?；ǖ念伾?，轉(zhuǎn)入了多拷貝的牽?；ㄉ睾铣苫颍ň幋a查兒酮合成酶,可催生紅色素），但在部分牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)顏色沒(méi)有變深，反而變淺，甚至部分花朵為純白色。轉(zhuǎn)基因沉默可以發(fā)生在染色體上、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后三種不同的層次上。發(fā)生在染色體上的轉(zhuǎn)基因沉默叫做位置效應(yīng)，發(fā)生在RNA轉(zhuǎn)錄水平上的轉(zhuǎn)基因沉默叫做轉(zhuǎn)錄失活(transcriptionalinactivation)，而發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平的轉(zhuǎn)基因沉默的主要形式是轉(zhuǎn)錄后共抑制(post-transcriptionalcosunpression)，共抑制對(duì)真核細(xì)胞的基因表達(dá)是一個(gè)障礙。位置效應(yīng)：轉(zhuǎn)入基因（可以是單拷貝）在寄主染色體基因組上的插入部位及其周?chē)暮塑账峤M成，對(duì)入轉(zhuǎn)基因表達(dá)活性的影響。轉(zhuǎn)錄活躍的常染色質(zhì)區(qū)

重復(fù)序列區(qū)、異染色質(zhì)區(qū)、病毒附近等甲基化強(qiáng)烈、染色體濃縮，引起轉(zhuǎn)基因的沉默轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默：主要是由于啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化或是導(dǎo)入的基因發(fā)生異染色質(zhì)化所造成的，二者都和轉(zhuǎn)入基因重復(fù)序列有密切關(guān)系

外源基因如果以多拷貝的形式整合到染色體DNA的同一位點(diǎn)上，則不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，故而稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄失活，且拷貝數(shù)越多，基因沉默現(xiàn)象也就越嚴(yán)重。轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默：主要是轉(zhuǎn)錄后共抑制(post-transcriptionalcosuppression)現(xiàn)象。

轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默的特點(diǎn)是，外源基因能夠轉(zhuǎn)錄成mRNA但不能積累，mRNA一經(jīng)合成就被降解或被相應(yīng)的反義RNA或蛋白質(zhì)封閉，從而失去合成蛋白質(zhì)的功能（機(jī)理同RNAi類(lèi)似）。同時(shí)具有擴(kuò)散性。

依賴(lài)于同源性的基因沉默轉(zhuǎn)基因小鼠中帶有多個(gè)拷貝的-球蛋白基因，隨著位點(diǎn)特異性重組的發(fā)生，基因拷貝數(shù)降低，而小鼠體內(nèi)-球蛋白基因含量增加，同時(shí)隨著拷貝數(shù)的減少，該位點(diǎn)處的甲基化程度也降低。-球蛋白基因RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是由雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因靜默機(jī)制.RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制.目前已成功用于基因功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)上下游分子相互關(guān)系的研究隨著研究的不斷深入，RNAi的機(jī)制正在被逐步闡明，而同時(shí)作為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具（3）RNAi1995年，1995年Guo和Kemphues用反義RNA技術(shù)阻斷秀麗新小桿線蟲(chóng),發(fā)現(xiàn)注射正義RNA（senseRNA）和反義RNA均能有效并特異性地抑制秀麗新小桿線蟲(chóng)par-1基因的表達(dá)，該結(jié)果不能使用反義RNA技術(shù)的理論做出合理解釋。直到1998年，F(xiàn)ire等證實(shí)Guo等發(fā)現(xiàn)的正義RNA抑制同源基因表達(dá)的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA中污染了微量dsRNA而引發(fā)，并將這一現(xiàn)象命名為RNAi。

此后dsRNA介導(dǎo)的RNAi現(xiàn)象陸續(xù)發(fā)現(xiàn)于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲(chóng)、水螅、渦蟲(chóng)、斑馬魚(yú)等多種真核生物中，并逐漸證實(shí)植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA介導(dǎo)的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）現(xiàn)象均屬于RNAi在不同物種的表現(xiàn)形式。2006年，F(xiàn)ire和Mello因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)RNAi的機(jī)理而獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

（1）當(dāng)病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常產(chǎn)生一些dsRNA。（2）宿主細(xì)胞對(duì)這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)，其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段雙鏈RNA（大約21～23bp），即siRNA。（3）siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。

RNAi的作用機(jī)理（4）RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mRNA的降解反應(yīng)。（5）siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。應(yīng)用：構(gòu)建發(fā)卡RNA干擾構(gòu)件或兩端都有啟動(dòng)子的小基因片段來(lái)實(shí)現(xiàn)基因失活RNAi干擾現(xiàn)象的重要特征RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制；RNAi具有很高的特異性，只降解與之序列相應(yīng)的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNA；RNAi抑制基因表達(dá)具有很高的效率，表型可以達(dá)到缺失突變體表型的程度，而且相對(duì)很少量的dsRNA分子(數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于內(nèi)源mRNA的數(shù)量)就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，是以催化放大的方式進(jìn)行的；RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以穿過(guò)細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞間長(zhǎng)距離傳遞和維持信號(hào)甚至傳播至整個(gè)有機(jī)體以及可遺傳等特點(diǎn);dsRNA不得短于21個(gè)堿基，并且長(zhǎng)鏈dsRNA也在細(xì)胞內(nèi)被Dicer酶切割為21bp左右的siRNA，并由siRNA來(lái)介導(dǎo)mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)特異的RNA干擾，而是細(xì)胞非特異性和全面的基因表達(dá)受抑和凋亡；ATP依賴(lài)性：在去除ATP的樣品中RNA干擾現(xiàn)象降低或消失顯示RNA干擾是一個(gè)ATP依賴(lài)的過(guò)程?？赡苁荄iecer和RISC的酶切反應(yīng)必須由ATP提供能量。（4）核酶核酶：具有催化作用的RNA分子，能對(duì)單鏈RNA分子進(jìn)行特異性切割或連接。1982年，Cech等研究原生動(dòng)物四膜蟲(chóng)rRNA時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)rRNA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的I型內(nèi)含子的剪切及外顯子的拼接過(guò)程可在無(wú)任何蛋白質(zhì)存在的情況下發(fā)生，證明了RNA具有催化功能。1983年Altman等人在研究細(xì)菌RNaseP時(shí)發(fā)現(xiàn)，它具有兩個(gè)組分：一條RNA鏈（稱(chēng)為M1-RNA）和一個(gè)蛋白質(zhì)（稱(chēng)為C5蛋白）。它的功能是剪切tRNA分子上多余的或前體序列。而在體外當(dāng)約400個(gè)核苷酸的M1-RNA單獨(dú)存在時(shí)，也具有完成切割tRNA前體的功能，C5起著提高底物與RNaseP親和力的作用4.1核酶定義及種類(lèi)

核酶的發(fā)現(xiàn)，從根本上改變了以往只有蛋白質(zhì)才具有催化功能的概念，為此，Cech和Altman也因此獲得了1989年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。目前主要有四類(lèi)自體剪切型核酶：錘頭狀核酶，發(fā)夾狀核酶，瓦庫(kù)德衛(wèi)星序列核酶（Varkudsatellite）和丁型肝炎病毒核酶（Hepatitisdeltavirusribozyme）剪接型核酶：為內(nèi)含子，分為I型（內(nèi)含子不成環(huán)）和II型（內(nèi)含子成環(huán)）剪切型核酶：自體剪切型與異體剪切型（RNaseP）hairpinhepatitisdeltavirushammerhead瓦庫(kù)德衛(wèi)星序列核酶含150個(gè)以上的核苷酸，是目前發(fā)現(xiàn)的分子量最大結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的自切型核酶每一類(lèi)核酶都有序列保守的催化中心，天然核酶均發(fā)生順式作用進(jìn)行自裂解。錘頭狀核酶的研究最深入、其在基因工程中的應(yīng)用最具潛力。二級(jí)結(jié)構(gòu)自切型核酶錘頭狀核酶的裂解位點(diǎn)：5′-NUX-3′N(xiāo)為任意堿基，X是除G之外的任意堿基，目前發(fā)現(xiàn)的天然核酶中，裂解位點(diǎn)5′-GUC-3′最為常見(jiàn)。雖然天然核酶只能發(fā)生順式作用，但是可以人工合成核酶序列，進(jìn)行反式作用，裂解目標(biāo)基因的mRNA，達(dá)到抑制基因表達(dá)的目的。(破壞環(huán)I)4.2錘頭狀核酶特點(diǎn)中心區(qū)（催化）＋反義臂（定位）反式作用抑制基因表達(dá)效果非常高一個(gè)核酶構(gòu)件可以破壞許多mRNA動(dòng)力學(xué)特征限制了