高效制備色譜

11.9高效制備色譜

（HighPerformancePreparativeChromatography）

任何一種分離方式均可用于制備目的，色譜和電泳也不例外（注意實(shí)際效果?。１菊聝H介紹常用的液相色譜方法。

制備色譜是指采用色譜技術(shù)制備純物質(zhì)，即分離、收集一種或多種色譜純物質(zhì)。而利用高效液相色譜分離足夠量的混合物，并把分離所得的各組分逐個收集起來，得到高純度的樣品，稱為高效液相制備色譜。

可見，制備色譜中的“制備”這一概念指獲得足夠量的單一化合物，以滿足研究和其它用途。制備色譜的出現(xiàn)，使色譜技術(shù)與經(jīng)濟(jì)利益建立了聯(lián)系。制備量大小和成本高低是制備色譜的兩個重要指標(biāo)。氣相制備色譜主要用于石油化工產(chǎn)品和揮發(fā)性天然產(chǎn)物的色譜純樣品制備。表11.9.1儀器分析所需純樣品量

儀器樣品量（mg）NMR1-10FT-IR0.1-1IR1UV-Vis<1元素分析1-10MS0.01-1全面鑒定一樣品結(jié)構(gòu)10-50分離度分析速度分離樣品量思考：這三個指標(biāo)是相互制約達(dá)的，不同分離目的有不同要求。請具體分析：

1）分離分析2）制備分離

評價制備色譜效率的主要指標(biāo)是單位時間內(nèi)分離純物質(zhì)的量，以純組分量和該組分保留時間之比表示，定義為產(chǎn)率。另一指標(biāo)是最大允許分離樣品體積，它決定于固定相的負(fù)荷和色譜柱尺寸。塔板高度，mm容量因子

1E-51E-41E-31E-2

樣品量圖樣品量對塔板高度和容量因子的影響表11.9.2制備色譜和分析色譜的比較

制備色譜分析色譜分離目的單位時間內(nèi)獲得符合純度的物質(zhì)量獲得混合物中各組分的信息（定性定量）色譜模型非線性色譜線性色譜儀器設(shè)備制備柱、高流量、大進(jìn)樣、低檢測（高通量）高壓穩(wěn)流、高精度進(jìn)樣、高靈敏檢測（高重現(xiàn)性）

液相色譜制備純物質(zhì)的目的：結(jié)構(gòu)鑒定，生物和毒理試驗，以及某些珍貴或難分離單組分物質(zhì)的生產(chǎn)。11.9.1制備色譜分離的一般考慮

任何制備分離的色譜模型都和分析分離的模型相類似。在制備色譜中，容量因子取決于樣品量。如果柱子在超載的狀態(tài)下工作，增加柱長比降低壓力、增加柱效效果好。當(dāng)然，制備色譜中的分離度比分析分離度更為重要。

當(dāng)柱子在超載時，大量樣品進(jìn)入柱子，使得分離度、塔板數(shù)和容量因子隨超載的狀況而變化。在制備色譜過程中單位時間產(chǎn)量的提高可通過增加流速和增加柱子的載量來實(shí)現(xiàn)。圖不同進(jìn)樣量時流速對分離度的影響流速，cm/secl

大顆粒（~50μm）大直徑柱，在超載狀態(tài)下完成相對大量的制備11.9.2制備色譜模型

在制備色譜中，為提高分離量，制備色譜一般是在非線性范圍內(nèi)運(yùn)行。非線性色譜是制備色譜的理論基礎(chǔ)，非線性色譜方程可以用一個濃度波的運(yùn)動方程表示。制備色譜的溶質(zhì)的保留時間：

可見，許多流行于分析型液相色譜的概念或參數(shù)在制備色譜中不太適用。使用這些結(jié)論容易被引入歧途。如：分離度、柱效柱和峰型的對稱性在討論制備色譜最佳化時往往很少考慮。制備色譜的三種運(yùn)行模式主成分多組分微量組分超載有溶質(zhì)超載和體積超載兩種。溶質(zhì)超載是指柱體積小，但樣品濃度超過吸附等溫線的線性范圍，出現(xiàn)的峰型不對稱，峰前沿陡峭而后部拖尾；體積超載是指進(jìn)樣體積比較大，樣品濃度恒定，應(yīng)限制在吸附等溫線的線性范圍內(nèi)，洗脫的峰型高、對稱或是個大平頂。制備條件的選擇，包括上柱量、容量因子、選擇性以及柱效。Knox和Pyper研究指出，分離純化的基本參數(shù)是得到最大的選擇性和高濃度的制備物質(zhì)。在高濃度下，無論是溶質(zhì)超載還是體積超載都保證了制備產(chǎn)量的提高。但體積超載要比溶質(zhì)超載得到的產(chǎn)量低。高濃度的質(zhì)量超載，在分離過程中避免了大體積引起的峰的擴(kuò)張，在制備色譜中具有更大的優(yōu)點(diǎn)。

制備色譜的進(jìn)樣體積：

對于k’=4，流出液組分濃度可達(dá)0.03%--0.3%，大小與α有關(guān)。

最大純化產(chǎn)量與容量因子的關(guān)系分析分離增加分離度增大進(jìn)樣量超載條件11.9.3實(shí)驗條件的選擇

1）柱體積與填料

液-固色譜是制備色譜中常用的一種模式，而液-固色譜中流動相選擇很重要。流動相首先應(yīng)使制備組分有較大的溶解度，且容易從純化后的組分中除去。一般小顆粒（5-10μm）用于高分離度的制備，粗顆粒（30-60μm）用于超載的高容量制備。樣品容量的大小與填料的用量有關(guān)，而與顆粒度的關(guān)系不大。均勻的粗顆粒填料，多用于高樣品量的制備。內(nèi)徑0.8-1.0cm，填有10μm顆粒度的填料的半制備柱，多用于重復(fù)分離和提純產(chǎn)品的制備。

另一種類型的制備柱是徑向壓縮柱：內(nèi)管采樣塑料管，可自己裝填規(guī)膠等填料。使用時，在管壁四周加壓，大大減少了填料顆粒之間，以及填充床管與管壁之間空體積，從而提高了柱效。1）流動相對于非極性或中極性的有機(jī)合成產(chǎn)物，常用硅膠柱分離。流動相應(yīng)首先用己烷和特丁基甲醚，后者作為極性改性劑調(diào)節(jié)溶劑極性，且不會生成過氧化物。如果要提高選擇性和改變極性，用二氯甲烷比較合適。加壓

1）樣品前處理粗制品預(yù)先用抽提、蒸餾或重結(jié)晶等方法凈化。合成產(chǎn)物一般用快速柱色譜粗分離。必要時，在制備色譜前加一保護(hù)柱，避免雜質(zhì)損壞制備柱。2）純組分的回收收集后的樣品組分的有機(jī)溶劑一般用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方式除去；水分則采用冷凍干燥除去；流動相中的有機(jī)溶劑常用閃蒸方式回收。采用制備色譜得到的純物質(zhì)的主要雜質(zhì)可能是流動相中的不溶物，如填料離解物。

11.9.4制備色譜儀l

輸液能力達(dá)100mL/min，壓力在200kg/cm2

左右l

進(jìn)樣器0.5~5mLl

檢測器：“縮小光程和采用分流”，如0.2~0.5cm的UV池或RI測定l

餾分收集器：定時收集或定體積收集l

再循環(huán)閥和溶劑再生裝置一般的分析型高效液相色譜儀可以換上內(nèi)經(jīng)在10mm的半制備柱完成一定的制備任務(wù)。11.9.5徑向流動色譜色譜柱裝填成一定厚度的圓筒形狀，內(nèi)外圓柱用兩多孔濾膜固定。流動相及樣品液從軸向進(jìn)樣口引入，徑向通過進(jìn)樣管流向柱子外周，樣品流過多孔濾膜后進(jìn)入色譜床開始選擇性分離，最后由內(nèi)芯通道流出。與軸向流動相比，徑向流動的進(jìn)樣面積很大；柱壓降低；流量增大，有利于規(guī)模制備，特別是具有生理活性的大分子物質(zhì)的分離提純。但軸向流動柱的設(shè)備較復(fù)雜，價格更貴。樣品液/溶劑流出液11.9.6應(yīng)用舉例

合成中的制備色譜條件選擇一般應(yīng)參考薄層色譜條件、快速柱色譜初分條件、分析柱色譜或小規(guī)模柱分離探索分離條件，再擴(kuò)大到同類型的制備柱分離。如對復(fù)雜樣品或未知樣品的提取和純化，通常采用分析柱探索分離條件，然后按規(guī)模放大分離。在一般情況下，制備色譜的分離度()應(yīng)大于1.25，根據(jù)制備規(guī)模選擇色譜柱，然后分析色譜的優(yōu)化條件放大進(jìn)樣量、流速以及梯度條件等，最后在制備色譜中進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。在合成反應(yīng)中，常采用點(diǎn)板實(shí)驗進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定。一般的說，比移值在0.2~0.8的化合物較適合于制備色譜。根據(jù)關(guān)系式可以估計制備色譜的流動相組成。考慮到薄層板可能含有粘合劑、熒光劑等，流動相的組成要進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

1）制備手性色譜拆分氧氟沙星光學(xué)異構(gòu)體2）合成羥基吡咯烷類化合物的制備純化3）高效液相制備分離抗氧劑1010加成反應(yīng)副產(chǎn)物HPLC拆分氧氟沙星（氟哌酸）

國內(nèi)使用外消旋的OFLOXCIN,而日本已開發(fā)左旋氧氟沙星（LEVOFLOXCIN）,商品名Cravit。用6mmol/Ll-phen+CuSO4+15%CH3OH(pH3.5)，Shim-ParkPREPODS(20mm×25cm),4.6mL/min,293nm,0.5ml15g/L(±)OFLS-(-)-OFLR-(+)-OFL色譜新技術(shù)（結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研自學(xué)）高速逆流色譜(High-speedCountercurrentChromatography,HSCCC)

連續(xù)逆流液液萃取:不用固態(tài)載體的液相分配色譜技術(shù)工作原理：一種獨(dú)特的流體動力學(xué)現(xiàn)象一種連續(xù)的實(shí)用分離制備技術(shù)

HSCCC是由美國國立衛(wèi)生院Ito博士研制開發(fā)的一種獨(dú)特的不用固態(tài)載體的液相分配色譜技術(shù),是一種能實(shí)現(xiàn)連續(xù)有效分離的實(shí)用分離制備技術(shù)。逆流色譜是一種基于連續(xù)逆流液液萃取的色譜型分離裝置,它與不需要固相載體,只需要一個適宜的萃取分離體系。裝有不相混溶兩相液體的容器(轉(zhuǎn)鼓)在一個力場中轉(zhuǎn)動時會造成一個多級的混合澄清體系,被分離的溶質(zhì)在流出液中通常會呈現(xiàn)各個分離的譜峰。

HSCCC螺旋管內(nèi)區(qū)混合運(yùn)動示意圖

兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)螺旋管內(nèi)的運(yùn)動分布：兩相溶劑體系在螺旋管內(nèi)存在兩種狀態(tài)（左圖）,一種是在背離中心軸的螺旋管內(nèi),互不相溶的兩相處于分離的位置,較重相(下相)處于螺旋管外側(cè),輕相(上相)處于螺旋管內(nèi)側(cè)。在朝向公轉(zhuǎn)軸線的方向的區(qū)域兩相激烈的接觸、混合、分配和傳遞。隨著流動相不斷的注入流出,樣品中分配系數(shù)小的組分先被洗脫出來,分配系數(shù)值較大的組分后被洗脫出來,最終達(dá)到分離的目的。

工作原理：利用的是螺旋管的方向性與高速行星式運(yùn)動相結(jié)合產(chǎn)生的一種獨(dú)特的流體動力