微生物的遺傳育種-誘變育種

項(xiàng)目二

微生物的遺傳變異和育種

(Microbialgenetics

andbreeding)任務(wù)三誘變育種用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對(duì)象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。

什么是誘變育種？誘變育種的2個(gè)主要環(huán)節(jié)：誘變（隨機(jī)）選用合適的誘變劑和誘變劑量處理大量均勻、分散的微生物細(xì)胞，以引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時(shí)，使存活個(gè)體中的突變頻率大大提高。篩選（定向）設(shè)計(jì)有效的篩選方法，將少量正變株中的優(yōu)良菌株挑選出來。誘變育種中的幾個(gè)原則：(1)選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑(2)挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株(3)處理單細(xì)胞或單孢子懸液(4)選用最適的誘變劑量(5)充分利用復(fù)合誘變的協(xié)同效應(yīng)(6)利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)(7)設(shè)計(jì)高效的篩選方案(8)創(chuàng)造新型篩選方法1.誘變育種的設(shè)計(jì)前期準(zhǔn)備工作單細(xì)胞懸液的制備誘變劑及誘變劑量的選擇誘變處理突變體的分離與篩選優(yōu)良菌株出發(fā)菌株的選擇與純化一、誘變育種的設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備2.前期準(zhǔn)備工作

1.出發(fā)菌株的選擇與純化⑴對(duì)出發(fā)菌株的選擇⑵出發(fā)菌株的純化2.菌懸液(單孢子或單細(xì)胞懸液)的制備⑵菌懸液制備方法

①細(xì)菌前培養(yǎng)及誘變菌懸液制備同步化預(yù)培養(yǎng)35-37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期3-6℃培養(yǎng)1h20-24h培養(yǎng)基本培養(yǎng)基培養(yǎng)20-60min2℃保藏10min35-37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期加入一定濃度的嘌呤、嘧啶或酵母膏離心洗滌加入預(yù)冷的緩沖液或生理鹽水懸液加入玻璃珠用無菌脫脂棉或?yàn)V膜過濾振蕩10min調(diào)整濃度備用②產(chǎn)孢子的菌類預(yù)培養(yǎng)成熟而新鮮的孢子液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)孢子剛剛萌發(fā)（即芽長(zhǎng)相當(dāng)孢子直徑0.5-1倍）②產(chǎn)孢子的菌類制備懸液

加入緩沖液或生理鹽水振蕩打碎孢子團(tuán)塊以脫脂棉或G3-G5玻璃過濾器過濾孢子計(jì)數(shù)調(diào)整濃度備用離心洗滌三種方法：a.菌絲尖端法③不產(chǎn)孢子的真菌上數(shù)滴培養(yǎng)基接上菌絲培養(yǎng)后菌絲生長(zhǎng)延伸到蓋片以外的培養(yǎng)基上，揭去蓋片蓋片周圍部分尖端菌絲斷裂b.單菌落周圍菌絲尖端法選擇數(shù)個(gè)單菌落紫外線照射或加入殺菌率低的化學(xué)誘變劑對(duì)菌落四周延伸的菌絲尖端處理培養(yǎng)篩選常用化學(xué)誘變劑c.混合處理法培養(yǎng)后相當(dāng)年幼的菌絲體玻璃勻漿過濾小段菌絲的菌懸液進(jìn)行處理3.誘變劑及處理劑量的選擇

如：頭孢菌素C產(chǎn)生菌的有效誘變劑是：uv

、LiCl2烷化劑；青霉素產(chǎn)生菌以烷化劑更合適。a.遺傳穩(wěn)定的出發(fā)菌株：以前未使用過突變譜較寬誘變率高

b.遺傳性不穩(wěn)定的出發(fā)菌株：自然分離原始菌株出發(fā)菌株環(huán)境條件突變體篩選效價(jià)高、性能好的一類菌落溫和誘變劑處理選用的誘變劑是溫和的或曾經(jīng)是有效的誘變劑預(yù)實(shí)驗(yàn)：生產(chǎn)能力分類法最佳誘變劑的選擇⑵誘變劑的種類（高效，簡(jiǎn)便）物理誘變劑：

頻度低、大損傷，難修復(fù)，且操作簡(jiǎn)便；化學(xué)誘變劑：

頻度高，點(diǎn)突變，易回復(fù)突變，操作麻煩。(NTG——超誘變劑）UV是最常用的一種誘變劑濃度、處理時(shí)間、處理?xiàng)l件照射源、照射距離、照射時(shí)間、處理?xiàng)l件⑶最適誘變劑量的選擇

①誘變劑量的確定———突變劑量曲線②誘變劑對(duì)產(chǎn)量性狀的誘變作用，大致有如下趨向：多少4.誘變處理⑴誘變處理方式復(fù)合因子適合于遺傳性穩(wěn)定的純種及生活能力強(qiáng)的菌株處理，能導(dǎo)致較大的突變。先弱后強(qiáng)⑵誘變處理方法具體做法

適用于誘變力強(qiáng)而殺菌率低的誘變劑，或只對(duì)DNA復(fù)制起作用的誘變劑。出發(fā)菌株菌體的稀釋液接種培養(yǎng)接種分離紫外線使用UV照射最為方便。取5ml單細(xì)胞懸液置于直徑6cm的培養(yǎng)皿中，開蓋照射；時(shí)間不短于10~20s，也不長(zhǎng)于10~20min。挑選優(yōu)良菌株15W、30cm5mL1.誘變育種篩選的基本環(huán)節(jié)三、突變株的分離與篩選設(shè)計(jì)和采用效率高的篩選方案和方法極其重要。篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟.篩選方案⑴常規(guī)篩選程序2.篩選的程序?qū)㈦S機(jī)挑選的菌落直接接入搖瓶培養(yǎng)，產(chǎn)物用常規(guī)法測(cè)定⑵定向篩選程序改進(jìn)之處：①預(yù)篩采用瓊脂塊法。②初篩搖瓶發(fā)酵液中產(chǎn)物的分析采用簡(jiǎn)便、快速的瓊脂平板測(cè)定法。預(yù)篩部分微生物菌株經(jīng)過誘變處理后，變異菌株的菌落形態(tài)與生理特性、生產(chǎn)性能變化有一定的相關(guān)性。如目標(biāo)產(chǎn)物與色素之間具有一定相關(guān)性。⑴根據(jù)形態(tài)篩選變株3.菌落預(yù)篩的方法⑵根據(jù)平板菌落生化反應(yīng)篩選變株定性和半定量檢測(cè)⑶采用冷敏感菌篩選抗生素變株冷敏感菌是從人的病原菌中經(jīng)誘變分離出的低溫敏感變異株，在20℃下不能生長(zhǎng)，可作為檢驗(yàn)菌使用。誘變后的放線菌孢子懸浮液冷敏菌+混合20℃培養(yǎng)3-4d抗生素產(chǎn)生菌正常形成菌落37℃培養(yǎng)18-20h冷敏菌迅速生長(zhǎng)形成抑菌圈菌落成熟且抗生素產(chǎn)量達(dá)高峰操作：⑷濃度梯度法一個(gè)菌株合成抗生素的水平與其耐自身產(chǎn)物能力大小有關(guān)。耐受性越強(qiáng)，抗生素產(chǎn)生能力也越強(qiáng)?？股叵♂尫蛛x菌體細(xì)胞培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落挑取高濃度菌落雙層法制成濃度梯度平板⑸應(yīng)用影印技術(shù)快速篩選突變株篩選產(chǎn)脂野生株和具有高脂含量的突變株，需選擇適合的染料合理設(shè)計(jì)培養(yǎng)基該法是日本學(xué)者八木建立的，而由Ichilawa等在春雷霉素產(chǎn)生菌選育中得到應(yīng)用，取得令人滿意的效果。⑹瓊脂塊法大通量篩選突變株四、營養(yǎng)缺陷型菌株的誘變和篩選凡是能滿足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。凡是能滿足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)的天然或半合成培養(yǎng)基。在MM中有針對(duì)性地加入一或幾種營養(yǎng)成分以滿足相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)的合成培養(yǎng)基。營養(yǎng)缺陷型的篩選三類培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）[x]補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）[x]完全培養(yǎng)基（CM）[+]完全培養(yǎng)基（CM）[+]完全培養(yǎng)基（CM）[+]基本培養(yǎng)基（MM）[-]凡是能滿足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基?？股胤ňz過濾法青霉素法制霉菌素法原菌株(出發(fā)菌株)誘變劑處理淘汰野生型檢出缺陷型鑒定缺陷型同一培養(yǎng)皿夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法不同培養(yǎng)皿逐個(gè)檢出法影印接種法生長(zhǎng)譜法1.營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選步驟Auxo的濃縮中間培養(yǎng)2.營養(yǎng)缺陷型的誘變用于誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型的誘變劑有亞硝基胍，紫外線、亞硝酸等。其中亞硝基胍誘發(fā)頻率極高，一般可達(dá)10％。

3.中間培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)過夜）目的：克服表型延遲表型延遲（phenotypiclag）：表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象.

分離性延遲：突變的基因經(jīng)DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后變成純合狀態(tài)，表型才能表現(xiàn)出來。

生理性延遲：

由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)，突變表型仍不能表現(xiàn)出來。4.淘汰野生型菌株⑴抗生素法適用于：細(xì)菌和真菌原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生長(zhǎng)著的微生物細(xì)胞，對(duì)休止態(tài)細(xì)胞無作用。方法：將菌培養(yǎng)在含抗生素的MM基中采用青霉素法淘汰野生型細(xì)菌的方法和步驟：⑵菌絲過濾法適用于：絲狀（放線菌、霉菌）原理：基本培養(yǎng)基上只有野生型發(fā)育成菌絲；突變孢子可通過濾膜，野生型菌絲不能通過。⑶高溫殺菌法適用于：芽孢菌原理：利用芽孢菌類的芽孢和營養(yǎng)體對(duì)熱的敏感性差異，野生型芽孢蔭發(fā)，營養(yǎng)缺陷型芽孢不萌發(fā)。則加熱后，野生型細(xì)胞大部分被殺死，缺陷型保留下來。5.營養(yǎng)缺陷型的檢出①點(diǎn)植對(duì)照法

②影印法該法效率高，適用于細(xì)菌、酵母菌及小型菌落的放線菌和霉菌。影印平板培養(yǎng)法母平板滅菌的絲絨印章另一選擇培養(yǎng)基也稱延遲補(bǔ)給法。本法用于細(xì)菌更為合適。③夾層法先出現(xiàn)④限量補(bǔ)充培養(yǎng)法6.營養(yǎng)缺陷型的鑒定⑴鑒定方法①在一個(gè)平皿中加入一種營養(yǎng)物質(zhì)以測(cè)定多株缺陷型菌株(10-50株)對(duì)該生長(zhǎng)因子的需求情況。②在同一平皿上測(cè)定一種缺陷型菌株對(duì)多種生長(zhǎng)因子的需求情況，稱為生長(zhǎng)譜法。⑵營養(yǎng)缺陷型鑒定步驟測(cè)定缺陷型菌株所需生長(zhǎng)因子的類別具體測(cè)定缺陷該類別物質(zhì)中的哪種生長(zhǎng)因子用單一生長(zhǎng)因子進(jìn)行復(fù)證試驗(yàn)a.先選擇缺陷型菌株所需用的類別代表物質(zhì)。①氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白陳，代表氨基酸類。②酵母浸出液，其中氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶均具有。③維生素混合物，代表維生素類。④核酸堿基混合液或酵母核酸(0.1％堿水解物)，代表嘌呤、嘧啶類。

缺陷型類別的測(cè)定b方法稀釋后的菌懸液取0.1m1加入到基本培養(yǎng)中圓濾紙分別浸濕沾取以上四類代表物質(zhì)1324缺陷型所需生長(zhǎng)因子的測(cè)定以氨基酸缺陷為例進(jìn)行說明,將18種氨基酸按右表分為6組特點(diǎn)：每2組只有一種共同物質(zhì)組別化合物代號(hào)1178910112271213141533812161718449131619205510141719216611151820211352467.缺陷型菌的應(yīng)用作為菌株的遺傳標(biāo)記：進(jìn)行基因工程、誘變育種、研究代謝過程時(shí)