菌種保藏赤峰工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院

菌種保藏菌種的保藏

菌種是重要的生物資源，研究和選擇良好的菌種保藏方法具有重要的意義。一、菌種保藏的目的

菌種保藏的重要意義就在于盡可能保持其原有性狀和活力的穩(wěn)定，確保菌種不死亡、不變異、不被污染，以達(dá)到便于研究、二、菌種保藏的原理首先應(yīng)該挑選典型菌種的優(yōu)良純種來進(jìn)行保藏，最好保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等。其次應(yīng)人為地創(chuàng)造環(huán)境條件（如：干燥、低溫和缺氧），使微生物長期處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。盡可能多的采用不同的手段保藏一些比較重要的微生物菌株三、菌種保藏方法各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一樣。一種良好的有效保藏方法，首先應(yīng)能保持原菌種的優(yōu)良性狀長期不變，同時(shí)還須考慮方法的通用性、操作的簡便性和設(shè)備的普及性。

斜面低溫保藏法甘油冷凍管保藏法試管熔封（密封）保藏法石蠟油封藏法砂土管保藏法麩皮保藏法冷凍真空干燥保藏法液氮超低溫保藏法（一）斜面低溫保藏法－常用保藏法將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全

后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時(shí)間（保藏

期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，

如此連續(xù)。此法適用于細(xì)菌、霉菌、酵母菌及放線菌保藏短期保藏.此法的主要保藏措施是低溫。一般可保存1～6個(gè)月左右。優(yōu)點(diǎn)：簡便易行、容易推廣，適用于大多數(shù)微生物缺點(diǎn)：菌株仍有一定程度的代謝活動(dòng)能力，保藏期短；傳代次數(shù)多；菌種容易發(fā)生變異和被污染。大腸桿菌斜面金黃色葡萄球菌斜面生孢梭菌白色念珠菌

需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基真菌培養(yǎng)基（二）甘油冷凍管保藏法將待保藏菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時(shí)間后，用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝于試管中的無菌蒸餾水中，調(diào)正菌液濃度，使其等同于麥?zhǔn)媳葷峁艿?0號管，向已制備好的菌懸液中加入等體積、濃度為20%的無菌甘油，得到10%甘油菌懸液。輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混合，分裝無菌小管，最好在-30℃條件下儲(chǔ)存，一般可保存2年.（三）試管熔封（密封）保藏法熔封用各種瓊脂斜面（普通肉湯等）常規(guī)滅菌后，經(jīng)接種，室溫培養(yǎng)24～48h后，將接種菌生長旺盛的試管用噴燈將其管口熔封，分別置室溫和冰箱下保存。使用時(shí)，用砂輪在管口劃一圈，在乙醇燈下火煙滅菌后敲開管口即可轉(zhuǎn)接到另一斜面上。室溫保存期可達(dá)3年，特別是適宜一些因培養(yǎng)物陳舊極易死亡的銅綠假單菌。密封

將需保存種菌按無菌操作要求接種至固體培養(yǎng)基塞緊棉塞，放在干燥器內(nèi)，干燥器密封處涂上凡士林，蓋緊后使之與真空泵相連接。開動(dòng)真空泵抽真空30min至1h（真空度約為640）關(guān)閉密封口，撥出膠塞，置于室溫下保存。待用時(shí)，打開蓋，取出種菌，接種至培養(yǎng)基上即可。（四）石蠟油封藏法此法是在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端1cm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加硅膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。此法的主要保藏措施是低溫、阻氧。一般可保存1～2年左右。（五）冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。它通常是用保護(hù)劑制備擬保藏菌種的細(xì)胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即熔封，造成無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。此法適用于各大類微生物。此法的主要保藏措施是低溫、干燥、缺氧、有保護(hù)劑，保藏期一般長達(dá)5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備。（六）液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護(hù)劑，在液氮超低溫（－196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌種細(xì)胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過細(xì)胞膜外滲出來，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細(xì)胞損傷。此法適用于各種微生物菌種的保藏。此法的主要保藏措施是超低溫、有保護(hù)劑，保藏期一般可達(dá)到15年以上，是目前公認(rèn)的最有效的菌種長期保藏技術(shù)之一。此法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、高效，且可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏。其缺點(diǎn)是需購置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費(fèi)用較高。菌種的保藏條件及時(shí)間菌種培養(yǎng)基保存條件及時(shí)間大腸埃希菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4℃~6℃保存2~3個(gè)月金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4℃~6℃保存2~3個(gè)月枯草芽孢桿營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4℃~6℃保存3~6個(gè)月銅綠假單胞菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基室溫沙門菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4℃~6℃保存2~3個(gè)月生孢梭菌硫乙醇酸鹽培基4℃~6℃保存6個(gè)月以上白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基4℃~6℃保存4~6個(gè)月黑曲霉改良馬丁培養(yǎng)基4℃~6℃保存4個(gè)月菌液的制備取銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中置35～37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h；白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物少許

接種至改良馬丁培養(yǎng)基中置23～28℃霉菌

培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。黑曲霉的菌液制備：

將黑曲霉的孢子接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于23～28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7天，使大量的孢子產(chǎn)生。加入3～5ml的0.9%無菌氯化鈉溶液，用無菌玻棒或接種環(huán)輕輕將孢子洗脫，然后，用一支管口塞有無菌棉花的無菌球形毛細(xì)吸管吸出孢子菌液至無菌試管內(nèi)，可用比濁法或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基注皿（1ml），按規(guī)定條件培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。菌液的稀釋方法細(xì)菌的生長曲線細(xì)菌群體的生長繁殖可分為四期：

一期：遲緩期（lagphase）

細(xì)菌接種至培養(yǎng)基后，對新環(huán)境有一個(gè)短暫適應(yīng)過程（不適應(yīng)者可因轉(zhuǎn)種而死亡）。此期曲線平坦穩(wěn)定，因?yàn)榧?xì)菌繁殖極少。遲緩期長短因種類、接種菌量、菌齡以及營養(yǎng)物質(zhì)等不同而異，一般為1～4小時(shí)。此期中細(xì)菌體積增大，代謝活躍，為細(xì)菌的分裂增殖合成、儲(chǔ)備充足的酶、能量及中間代謝產(chǎn)物。

二期：對數(shù)期(logarithmicphase)

又稱指數(shù)期(exponentialphage)。此期生長曲線上活菌數(shù)直線上升。細(xì)菌以穩(wěn)定的幾何級數(shù)極快增長，可持續(xù)幾小至幾天不等（視培養(yǎng)條件及細(xì)菌代時(shí)而異）。此期細(xì)菌形態(tài)、染色、生物活性都很典型，對外界環(huán)境因素的作用敏感，因此研究細(xì)菌性狀以此期細(xì)菌最好?？股刈饔?，對該時(shí)期的細(xì)菌效果最佳。三期：穩(wěn)定期（stationaryphase）

該期的生長菌群總數(shù)處于平坦階段，但細(xì)菌群體活力變化較大。由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗、毒性產(chǎn)物（有機(jī)酸、H2O2等）積累ph下降等不利因素的影響，細(xì)菌繁殖速度漸趨下降，相對細(xì)菌死亡數(shù)開始逐漸增加，此期細(xì)菌增殖數(shù)與死亡數(shù)漸趨平衡。細(xì)菌形態(tài)、染色、生物活性可出現(xiàn)改變，并產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物如外毒素、內(nèi)毒素、抗生素、以及芽胞等。四期：衰亡期（declinephase）

隨著穩(wěn)定期發(fā)展，細(xì)菌繁殖越來越慢，死亡菌數(shù)明顯增多。活菌數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間呈反比關(guān)系，此期細(xì)菌變長腫脹或畸形衰變，甚至菌體自溶，難以辯認(rèn)其形。生理代謝活動(dòng)趨于停滯。故陳舊培養(yǎng)物上難以鑒別細(xì)菌。

細(xì)菌的分離培養(yǎng)技術(shù)—平板劃線分離法一.連續(xù)劃線分離法：此法用于含菌量少的菌液。先將培養(yǎng)物于平板1/5處密集涂布，然后來回做曲線連續(xù)劃線接種，線于線之間有一定的距離，劃滿平板為止。二.分區(qū)劃線分離法：此法用于含菌量多的菌液。先將培養(yǎng)物涂布于平板表面邊緣第一區(qū)，約占平板1/5面積，再在二、三、…區(qū)依次連續(xù)劃線。每劃完一個(gè)區(qū)，均將接種環(huán)滅菌一次。每一區(qū)的劃線均接觸上一區(qū)的接種線1~2次，使菌量逐漸減小，以獲得單個(gè)菌落。細(xì)菌分離培養(yǎng)的直觀圖純培養(yǎng)

所謂微