環(huán)境生物學(xué)第七章第三節(jié)

7.3細胞工程與環(huán)境污染生物治理7.3.1細胞工程概述細胞工程(CellEngineering)的定義

在細胞水平上（細胞增殖、分化、死亡）研究、開發(fā)和利用各類細胞的工程。細胞工程的發(fā)展主要建立在細胞融合（cellfusion）的基礎(chǔ)上，人們可以根據(jù)需要，經(jīng)過科學(xué)設(shè)計，在細胞水平上改造生物的遺傳物質(zhì)。它所要求的技術(shù)條件、實驗設(shè)備及試劑、經(jīng)費等均比基因工程要求的低一些。37℃40min促融劑人細胞小鼠細胞紅色熒光染料標記的膜蛋白氯色熒光染料標記的膜蛋白融合細胞細胞工程的主要方法⊙細胞培養(yǎng)（cellculture）

將細胞從生物體內(nèi)取出，然后在特制的培養(yǎng)容器內(nèi)給予必要的生長條件，使其在體外（invitro）繼續(xù)生長與繁殖。細胞培養(yǎng)有動物細胞培養(yǎng)、植物的花粉、原生質(zhì)體的培養(yǎng)。幼齡動物剪碎組織胰蛋白酶處理細胞培養(yǎng)⊙細胞融合（cellfusion）

在一定的條件下，將兩個或多個細胞融合為一個細胞的過程，細胞融合又稱細胞雜交?；蛐拖嗤募毎诤铣傻碾s交細胞稱為同核體；來自不同基因型的雜交細胞則稱為異核體。細胞的融合過程，最初是細胞在促融因子作用下，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，細胞之間的質(zhì)膜發(fā)生粘連，細胞質(zhì)開始融合，然后在培養(yǎng)過程中，進而發(fā)生核融合，形成雜種細胞?！鸭毎亟M

在體外條件下，運用試驗技術(shù)從活細胞中分離出各種細胞的結(jié)構(gòu)或組件，再根據(jù)需要把它們在不同的細胞之間重新進行裝配，成為具有生物活性的細胞。重組有核移植和細胞器移植：①

核移植——

主要是借助顯微操作儀，在顯微鏡下用微吸管把一個細胞中的細胞核吸出，直接移到另一個去核的細胞中。②

細胞器移植——

通過原生質(zhì)體對已分離純化的葉綠體的胞飲作用，進行葉綠體移植，或通過微注射、載體轉(zhuǎn)移以及胞飲攝入進行線粒體移植。顯微操作儀⊙遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移——基因在細胞水平的轉(zhuǎn)移①

載體法——

利用雙子葉植物如番茄、甜菜、棉花和大豆等常用載體轉(zhuǎn)移基因的方法，將含有外源基因的根瘤農(nóng)桿菌與受體原生質(zhì)體共同培養(yǎng)，或?qū)⒑型庠椿虻馁|(zhì)粒和受體原生質(zhì)體用聚乙二醇（PEG）處理轉(zhuǎn)化，最后由轉(zhuǎn)化體培育成轉(zhuǎn)化植物。②

直接導(dǎo)入法——

最常用的是微注射法，即在顯微操作儀的幫助下，用微針直接對細胞進行注射，直接將外源基因注入到一個受體的受精卵的核內(nèi)，然后合子便能發(fā)育成胚，并進一步發(fā)育成為成熟的個體。細胞工程的內(nèi)容

包括微生物細胞工程、植物細胞工程和動物細胞工程，目前主要應(yīng)用微生物細胞工程進行污染生物治理?！盐⑸锛毎こ?/p>

微生物細胞工程應(yīng)用微生物進行細胞水平的研究和生產(chǎn)，具體內(nèi)容包括各種微生物細胞的培養(yǎng)（發(fā)酵工程）、遺傳性狀的改造（遺傳學(xué)、發(fā)酵工程、基因工程）、微生物細胞的直接利用或獲得細胞代謝產(chǎn)物等。其中微生物細胞原生質(zhì)體融合技術(shù)是構(gòu)建環(huán)境工程菌的基本技術(shù)?！镂⑸锛毎|(zhì)體融合技術(shù)——

首先經(jīng)培養(yǎng)獲得大量菌體細胞，用脫壁酶處理脫壁，制成原生質(zhì)體。然后將兩種不同菌株的原生質(zhì)體混合在一起，使原生質(zhì)體彼此接觸、融合，再使融合的原生質(zhì)體在合適的培養(yǎng)基平板上再生出細胞壁，并生長繁殖，形成菌落，最后測定參與融合的性狀重組或產(chǎn)量變化情況，以篩選出重組子。微生物細胞原生質(zhì)體融合的關(guān)鍵步驟：①原生質(zhì)體制備→

原生質(zhì)體（Protoplast）：細胞質(zhì)壁分離后去掉細胞壁所余下那部分結(jié)構(gòu)。原生質(zhì)體具備原有細胞的全部內(nèi)部結(jié)構(gòu)與生理性能，但是它完全無細胞壁，失去了細胞的剛性而呈球形，對滲透壓十分敏感。原生質(zhì)體比較容易吸收外來的DNA、蛋白質(zhì)等，同時，對外界理化因子比較敏感，在原生質(zhì)體外面僅存原生質(zhì)膜，在外界理化融合因子的誘導(dǎo)下，不同物種間的原生質(zhì)體間的質(zhì)膜相互融合雜交，并在適當?shù)臈l件下，融合的原生質(zhì)體再生出細胞壁并恢復(fù)原來完整的細胞形態(tài)與群落形態(tài)，構(gòu)成具有多種遺傳性狀的新物種。

脫壁：為了進行細胞融合，必須先除去細胞壁。目前常用的方法是酶解法（主要采用溶菌酶、纖維素酶等）。②融合重組→

把兩親株的原生質(zhì)體混合在一起，促進融合，然后將融合液涂布在平板上再生，檢出重組子。融合重組示意圖細胞壁溶菌酶細胞膜生長細胞原生質(zhì)體培養(yǎng)融合的原生質(zhì)體混合融合子原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合細胞壁再生誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法——化學(xué)誘導(dǎo)法：常用于細胞融合的化學(xué)促融劑是聚乙二醇（PEG），方法是：在得到兩親本原生質(zhì)體后，等量混合兩親本的原生質(zhì)體，加入適量的PEG和鈣離子溶液，保溫后，洗去多余的PEG，在選擇培養(yǎng)基上篩選出融合子?！娙诤戏ǎ航柚妶龅淖饔茫l(fā)細胞融合。③原生質(zhì)體再生成細胞→

原生質(zhì)體在等滲的培養(yǎng)基中重建細胞壁，恢復(fù)細胞完整形態(tài)，并能生長、分裂。④融合重組的測定→

通常采用染色體標記的遺傳重組體來檢測。7.3.2應(yīng)用舉例—利用原生質(zhì)體融合構(gòu)建環(huán)境工程菌芳香族化合物降解菌的構(gòu)建PseudomonasalcaligenesCO可降解苯甲酸酯和3-氯苯甲酸酯，但不能利用甲苯和1,4-二氯苯甲酸酯PseudomonasputidaR5-3可以降解苯甲酸酯和甲苯，但不能利用3-氯苯甲酸酯和1,4-二氯苯甲酸酯融合子CB1-9可以同時降解上述4種化學(xué)污染物假單胞菌乙二醇降解菌：Pseudomonasmendocina3RE-15甲醇降解菌：Bacilluslentus

3RM-2苯甲酸和苯降解菌AcinetobactercalcoaceticusT3的原生質(zhì)體融合菌株TEM-1可同時降解苯甲酸、苯、甲醇和乙二醇DNADNA融合纖維素降解菌的構(gòu)建脫氫雙香草醛（DDV）降解菌Fusobacteriumvarium對DDV的降解能力為3-10%脫氫雙香草醛降解菌Enterococcusfaecium對DDV的降解能力為3-10%融合細胞FE7菌株DDV降解率高達80%融合聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合制備細菌殺蟲劑玉米螟球形芽孢桿菌BacillussphaericusTS-1：殺：淡色庫蚊（雙翅目）蘇云金芽孢桿菌Bacillus