分選型流式細胞儀

FACSAriaⅡ

分選型流式細胞儀BD公司生物科學部BD公司簡介BD是由MaxwellW.Becton和FairleighS.Dickinson于1897年在紐約創(chuàng)立的，總部設(shè)在新澤西州。經(jīng)過100多年的發(fā)展，BD已成為世界上最大的醫(yī)療技術(shù)及醫(yī)療設(shè)備公司之一，它以領(lǐng)先的技術(shù)、卓越的產(chǎn)品質(zhì)量和誠實可信的服務(wù)贏得了全球用戶及合作伙伴的廣泛贊譽。BD一直是全球最專業(yè)、產(chǎn)品線最全的流式細胞儀生產(chǎn)商和流式技術(shù)領(lǐng)導者。全球市場占有率達到80％，中國市場占有率達到85%。

BD公司流式細胞儀FACSCaliburLSRIIFACSCantoIIInfluxFACSAriaIIAccuriC6LSRFortessaFACSVerseFACSJazzBDFACSAriaII－分選型流式細胞儀

2008年最新產(chǎn)品集多種專利技術(shù)和完美設(shè)計流式細胞術(shù)(FlowCytometry,簡稱FCM)是一種快速、準確、客觀的同時檢測直線流動狀態(tài)中單個顆粒多項物理及生物學特性，加以分析定量的技術(shù)，并可以對特定群體加以分選。研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物及人工合成微球等。流式細胞儀(FlowCytometer)集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機技術(shù)、細胞熒光化學技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。

基本概念液流系統(tǒng)光學系統(tǒng)電子系統(tǒng)數(shù)據(jù)儲存與分析系統(tǒng)分選系統(tǒng)流式細胞儀組成FluidicsCartCytometer液流系統(tǒng)AIRPRESSUREBULKINJECTIONSheathTankAIRPRESSUREASPIRATEDWASTE(VACUUM)ASPIRATEDWASTE(DEGAS)SHEATHFILTER0”–9”R1SheathRegulatorR2SampleRegulatorV17V20V5V6液流系統(tǒng)樣品流速的選擇

低流速：一般用于分辨率較高的分析，如DNA分析高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，影響分型。光學系統(tǒng)FluorescenceFSCdetectorSSCandFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)光信號11前向角散射光信號側(cè)向角散射光信號熒光信號FluorochromesOverview123電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換器：將光信號轉(zhuǎn)換成電信號

光電二極管

光電倍增管（PMT）放大器兩種放大方式：

線性放大（lin）

對數(shù)放大（log）線性放大：按光強度的線性關(guān)系輸出信號。用于FSC，SSC，細胞周期檢測，SP細胞檢測及分選等。對數(shù)放大：按光強度的對數(shù)關(guān)系輸出信號。用于大多數(shù)熒光染色實驗。時間

(μ秒)電壓脈沖面積脈沖高度脈沖寬度0電脈沖信號類型：

高度信號H

寬度信號W

面積信號A細胞周期中粘聯(lián)體區(qū)分AreaHeightThreshold閾值用于屏蔽噪音信號和碎片信號，只有高于等于閥值道數(shù)的信號才會被送入計算機進行處理。模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器FL2時間時間時間時間FSCFL1SSC時間FL3FL1數(shù)據(jù)處理器SSCFSCFL2

時間FL4數(shù)據(jù)儲存與分析系統(tǒng)數(shù)據(jù)儲存39,27139,271Event1Event2Event3FSCSSCFITCPE06012089101606530650160List-ModeData8967530,621PE-AFITC-A675TimePE-AFITC-AMaybeexportedasFCSfile39,27122,68830,6216,189FITC/PE雙染樣本數(shù)據(jù)顯示直方圖（Histogram）二維點圖（DotPlot）等高線圖（ContourPlot）密度圖（Density）三維圖（3DPlot）等直方圖：顯示單一參數(shù)（橫坐標）與通道細胞個數(shù)（縱坐標）。一條豎線代表一個細胞信號，多豎線累加形成峰圖，一個峰即一類細胞。二維點圖：一個點代表一個細胞信號。等高線圖：可顯示數(shù)據(jù)信號的疏密程度。密度圖：可顯示信號分布的疏密程度。三維圖（3DPlot）等AriaII的噴嘴位于檢測點的下方，因此更換噴嘴后無需重新調(diào)整激光光路1檢測2充電3偏轉(zhuǎn)4收集分選系統(tǒng)分析結(jié)果精準：需要高靈敏度和分辨率-石英杯流動池分選細胞純度：需要對目標細胞的準確定位-Accudrop和Sweetspot技術(shù)分選速度：保證純度前提下高度分選-分選速度70,000個細胞/秒分選后活性：需要整個系統(tǒng)各環(huán)節(jié)對細胞的保護-石英杯流動池，自動無菌管路清洗，溫控儀器性能狀態(tài)穩(wěn)定性：質(zhì)控程序的監(jiān)控和調(diào)整-CS&T儀器質(zhì)控程序及儀器狀態(tài)監(jiān)控流式細胞儀分選要素高靈敏度-弱表達樣本檢測DimstainingPEpopulationvisibleDimstaining高靈敏度——稀有樣本檢測待測細胞細胞群的比例并不總是這么高有時，很低十萬分之一此時，靈敏度和分辨率至關(guān)重要傳統(tǒng)透射光路采用長通/短通濾光片光信號經(jīng)過一次透射，信號損失15-20%多色分析時，熒光檢測靈敏度降低八角形/三角形接收裝置-BD專利采用全反射雙色光鏡光信號經(jīng)過一次反射，信號損失僅5%保證多色分析時的熒光檢測靈敏度光電倍增管帶通濾光片長通雙色反光鏡細胞通過激光束的流速變慢，激光照射時間更長，提高了激光激發(fā)效率流動池被光膠耦合在熒光接收物鏡上，提高了熒光收集效率，保證多色應用中最佳的靈敏度和分辨率固定光路，無需每日調(diào)節(jié)，機器隨開隨用，減少人為可變性，提高實驗重復性石英杯流動池

開機光路無需調(diào)整一鍵式操作無需操作者的豐富經(jīng)驗實驗結(jié)果的可重復性好實測檢測靈敏度：FITC:10MESFPE:10MESF實測分辨率：CV=1.6%

二極管激光器，安裝在分選模塊裝置左側(cè)

可以提供側(cè)液流圖像的照相機

用于觀察BDAccudropTM微球熒光的發(fā)射光濾光片Accudrop微球是一種熒光微球，被位于偏轉(zhuǎn)板下方的紅激光激發(fā)后，發(fā)射光可以透過側(cè)液流監(jiān)視器前方的濾光片，用于測量dropdelay。該系統(tǒng)由下列部分構(gòu)成：InterrogationpointDropdelayBreakoffWasteNozzle+Cellsinjected++-LaserDropdelay定義：Dropdelay即液滴延遲時間，指細胞通過檢測區(qū)到液滴分離的間隔時間意義：

Dropdelay如果能夠被準確確定，就可以保證包裹細胞的液滴表面不會充上相反的電荷，從而實現(xiàn)最高的分選純度及細胞得率

耗時：0.5到1.5小時輔助材料：熒光微球、熒光顯微鏡、 玻片、計算器傳統(tǒng)液滴延遲時間確定BD獨有專利Accudrop技術(shù)：Accudrop微球是一種熒光微球，被位于偏轉(zhuǎn)板下方的紅激光激發(fā)后，發(fā)射光可以透過側(cè)液流監(jiān)視器前方的濾光片，用于測量dropdelay。預先分選Accudrop熒光微球自動準確設(shè)置最佳液滴延遲時間無需手動調(diào)節(jié)，減少人為誤差保證實驗的分選純度和得率SweetSpot自動監(jiān)控功能液滴斷點監(jiān)測窗口自動調(diào)節(jié)振幅，維持斷點穩(wěn)定維持最佳液滴延遲狀態(tài)儀器阻塞報警，保護分選樣本不受污染，實現(xiàn)分選時無人看管分選模式Y(jié)ieldMask：如果目標顆粒位于該設(shè)定范圍內(nèi)，則含有目標顆粒的液滴和相鄰的液滴都被分選。PurityMask：如果非目標顆粒位于該設(shè)定范圍內(nèi)，則與其相鄰的含有目標顆粒的液滴將不被分選。PhaseMask：如果目標顆粒位于該設(shè)定范圍內(nèi)，則含有目標顆粒的液滴將不被分選。AccudropPlatesortingEnrichment2-Waysorting4-Waysorting影響分選細胞的活性的因素：細胞本身激光功率液路系統(tǒng)（噴嘴）分選系統(tǒng)的潔凈程度及溫度控制石英杯激發(fā)保證了用小功率激光的效率遠遠大于大功率空氣激發(fā)的效率，光毒性小，很好的保證細胞活性。穩(wěn)定而零剪切力液流系統(tǒng)設(shè)計最大程度的保證了細胞的活性，同時專利的噴嘴設(shè)計，進一步保證了細胞活性。既有樣本溫控系統(tǒng)也有收集倉溫控AriaⅡ自動無菌消毒清洗軟件向?qū)逑醋詣訄?zhí)行無菌分選結(jié)果保證，文獻支持

全自動標準化的無菌清洗流程，密閉式的上樣和分選收集倉，執(zhí)行一次可以保證整個管路系統(tǒng)在以后連續(xù)4天內(nèi)菌量為0的最佳效果。采用一管CS&T微球，方便檢測微球染料可以被任意激光激發(fā)，涵蓋常用染料熒光波譜自動調(diào)整PMT報告儀器性能參數(shù)：Qr，Br，CV，跟蹤儀器狀態(tài)自動調(diào)整激光延遲和面積因子BD公司專利技術(shù)CytometerSetup&TrackingSystemCS&T儀器質(zhì)控程序及儀器狀態(tài)監(jiān)控流式細胞術(shù)操作流程樣品制備流式染色、檢測數(shù)據(jù)分析細胞懸液的制備單細胞懸液（天然，機械研磨/消化）5×105～1×106cells/ml，約0.5～1ml，300目篩網(wǎng)過濾陰性對照：自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部熒光分子經(jīng)光照發(fā)出的熒光。自發(fā)熒光信號為噪聲信號。同型對照：自發(fā)熒光＋非特異熒光，使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合產(chǎn)生的背景染色實驗樣本：自發(fā)熒光＋特異熒光＋非特異熒光補償對照：雙色或多色分析中，熒光素發(fā)射光譜重疊時，使用單種熒光素標記的單克隆抗體和其余熒光素對應的同型對照抗體分別進行染色，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號設(shè)置對照及染色用同型對照或陰性對照管調(diào)節(jié)電壓使陰性群位于“左下角”用單陽性管依次調(diào)節(jié)相鄰熒光之間補償，如

FL1-%FL2，

FL2-%FL1染色體分選單克隆細胞分選腫瘤干細胞分選轉(zhuǎn)染細胞分選免疫或免疫相關(guān)細胞分選……細胞生理學研究細胞膜表面標記細胞內(nèi)標記細胞周期分析凋亡分析……流式細胞術(shù)的應用細胞生理學研究細胞相對大小和顆粒性分析細胞生理學研究細胞內(nèi)PH值檢測細胞生理學研究Ca2+流動性檢測：Ca2+是非常重要的細胞內(nèi)離子，在細胞膜到細胞漿的信號傳導中起重要的作用。細胞受到刺激后，胞內(nèi)Ca2+濃度會發(fā)生改變。最常用的染料：Indo-1,Fluo-3,Furared細胞生理學研究細胞活性分析：FluoresceinDiacetate進入活細胞后，被胞內(nèi)酯酶講解，生成熒光底物，活細胞會發(fā)綠色熒光細胞膜表面標記淋巴細胞亞群/活化分析血小板分析造血干細胞檢測腫瘤細胞標志物檢測白血病免疫分型細胞內(nèi)標記細胞內(nèi)細胞因子細胞內(nèi)標記基因編碼蛋白細胞內(nèi)標記磷酸化蛋白：

接收刺激后細胞的動態(tài)反應

刺激因子對特異