中藥指紋圖譜的研究與實踐課件

中藥指紋圖譜的研究與實踐第一部分概述一、建立中藥指紋圖譜質量標準的必要性質量穩(wěn)定的原料是生產質量穩(wěn)定的產品的先決條件。中藥材絕大部分來源于生物，其活性成分大部分為生物體內次生代謝產物，少數(shù)為初生代謝產物。產地、氣候、生態(tài)環(huán)境、栽培或養(yǎng)殖技術、產地加工、炮制方法等對中藥材的化學成分影響很大。大部分中藥的有效成分未被闡明或僅部分闡明。單一指標的定性、定量分析，不能有效地控制中藥材或中成藥的質量。確保中藥的生物等效性。三、中藥指紋圖譜的作用作為藥品的質量標準組成部分企業(yè)產品質量的內控標準企業(yè)藥品生產的過程控制企業(yè)產品創(chuàng)優(yōu)或打假第二部分中藥材指紋圖譜的建立品種藥用部位產地栽培技術產地加工方法炮制供試品的制備方法測定方法、條件的考察方法學考察：穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性對照指紋圖譜的建立中藥材指紋圖譜的定義：

中藥材指紋圖譜系指中藥材經適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示該中藥材特性的共有峰的圖譜。如果原藥材需經過特殊炮制（如醋制、酒制、炒炭等），則應制定原藥材和炮制品指紋圖譜的檢測標準。1、名稱中文名、漢語拼音2、來源原植、動物：科名、中文名、拉丁學名、藥用部位、產地、采收季節(jié)、產地加工、炮制方法等。礦物藥：礦物的類、族、礦石名或巖石名、主要成分、產地、產地加工、炮制方法等。來源動、植物藥材：應固定品種、藥用部位、產地、采收期、產地加工和炮制方法。礦物藥：固定產地和炮制、加工方法。供試品的取樣：保證供試品的代表性和均一性。3、供試品的制備應根據(jù)中藥材中所含化學成分的理化性質和檢測方法的需要，選擇適宜的方法進行制備。制備方法必須確保該中藥材的主要化學成分在指紋圖譜中的體現(xiàn)。對于注射劑用中藥材，可按注射劑制備工藝制備供試品，制定指紋圖譜。5、測定方法●包括測定方法、儀器、試劑、測定條件等?！駪鶕?jù)中藥材所含化學成分的理化性質，選擇適宜的測定方法，建議優(yōu)先考慮色譜方法?！駥τ诔煞謴碗s的中藥材，必要時可以考慮采用多種測定方法，建立多張指紋圖譜?！褚陨V方法制定指紋圖譜所采用的色譜柱、薄層板、試劑、測定條件等必須固定；以光譜方法制定指紋圖譜，相應條件也必須固定。6、指紋圖譜及技術參數(shù)(1)指紋圖譜●根據(jù)供試品的檢測結果，建立指紋圖譜。●采用HPLC和GC制定指紋圖譜，其記錄時間根據(jù)樣品所含成分的情況而定，一般為1小時；采用TLCS制定指紋圖譜，必須提供從原點至溶劑前沿的圖譜；采用光譜法制定指紋圖譜，必須按各種光譜的相應規(guī)定提供全譜?！窕瘜W成分類型復雜的品種，必要時可建立多張指紋圖譜?！裰讣y圖譜的建立：根據(jù)10批次以上供試品的檢測結果所給出的相關參數(shù)，制定指紋圖譜。(3)指紋圖譜的評價以指紋圖譜相似度評價軟件進行評價以相對保留時間和峰面積比值進行評價共有指紋峰面積的比值以對照品作為參照物的指紋圖譜，以參照物峰面積作為1，計算各共有指紋峰面積與參照物峰面積的比值；以內標物作為參照物的指紋圖譜，則以共有指紋峰中其中一個峰（要求峰面積相對較大、較穩(wěn)定的共有峰）的峰面積作為1，計算其他各共有指紋峰面積的比值。各共有指紋峰面積比值必須相對固定。峰面積比值的要求：Ai≥20％At:

SD≤±20％10%At≤Ai<20%At:

SD≤±25%Ai<10％At：峰面積比值不作要求，但必須標定相對保留時間。未達基線分離的共有峰，應計算該組峰的總峰面積作為峰面積，同時標定該組各峰的相對保留時間。二、起草說明目的在于說明制定指紋圖譜檢測標準中各個項目的理由，規(guī)定各項目指標的依據(jù)、技術條件和注意事項等。既要有理論解釋，又要有實踐工作的總結及試驗數(shù)據(jù)。1、名稱、漢語拼音闡明確定該名稱的理由與依據(jù)。已有國家標準或地方標準的中藥材，應引用標準上的名稱。其他著作或文獻上已記載的中藥材，應引用文獻名，提供依據(jù)。新發(fā)現(xiàn)的中藥材，應根據(jù)中藥命名原則進行命名。2、來源對于多來源的中藥材，必須固定單一品種。對于多藥用部位的中藥材，必須固定單一藥用部位。已有國家標準（包括藥典和部頒標準）的中藥材，應引用國家標準；已有地方標準的中藥材，除引用地方標準外，必須附標準的復印件。注射劑用中藥材一般固定一個產地，如固定多個產地，需制定各產地中藥材的指紋圖譜。3、供試品的制備說明選用制備方法的依據(jù)。供試品需要提取、純化，應考察提取溶劑、提取方法、純化方法等，提取、純化方法應力求最大限度地保留供試品中的化學成分。供試品需要粉碎檢測，應考察粉碎方法、粒度等。4、參照物的制備參照物的選擇及其依據(jù)。根據(jù)供試品中所含成分的性質，選擇適宜的對照品或內標物作為參照物。試驗樣品制備的依據(jù)。根據(jù)檢測方法的需要，選擇適宜的方法進行制備，說明制備理由。精密度試驗主要考察儀器的精密度。取同一供試品，連續(xù)進樣5次以上，考察色譜峰的相對保留時間、峰面積比值的一致性。采用相似度軟件評價，要求相似度大于0.9。人工評價：采用HPLC和GC制定指紋圖譜，在指紋圖譜中規(guī)定共有峰面積比值的各色譜峰，其峰面積比值的RSD不得大于3％，其他方法不得大于5％。采用光譜方法檢測的供試品，RSD不得大于3％。重現(xiàn)性試驗：主要考察實驗方法的重現(xiàn)性。取同一批號的供試品5份以上，按照供試品的制備方法制備供試品并進行檢測，考察色譜峰的相對保留時間、峰面積比值的一致性。采用相似度軟件評價，要求相似度大于0.9。人工評價：采用HPLC和GC制定指紋圖譜，在指紋圖譜中規(guī)定共有峰面積比值的各色譜峰，其峰面積比值的RSD不得大于3％，其他方法不得大于5％。采用光譜方法檢測的供試品，RSD不得大于3％。6、指紋圖譜及技術參數(shù)(1)指紋圖譜根據(jù)供試品的檢測結果制定指紋圖譜，采用阿拉伯數(shù)字標示共有峰，用“S”標示參照物的峰。采用HPLC和GC制定指紋圖譜，應提供對照指紋圖譜2倍以上的記錄圖，以考察樣品中的主要成分是否完全出峰。提供建立指紋圖譜的有關數(shù)據(jù)，包括各共有峰的相對保留時間、相似度或各共有峰面積的比值。采用光譜方法建立的指紋圖譜，也必須提供相應的數(shù)據(jù)。(2)共有指紋峰的標定根據(jù)10批次以上供試品的檢測結果，標定中藥材的共有指紋峰。說明標定共有指紋峰的理由。附各批供試品的圖譜。(3)共有指紋峰面積的比值根據(jù)10批次以上供試品圖譜中各共有指紋峰面積的比值，計算平均比值。列出各批供試品的檢測數(shù)據(jù)。分析各批供試品的檢測結果是否合格(4)非共有峰面積計算10批次以上供試品圖譜中非共有峰總面積及占總峰面積的百分比。列出各批供試品的檢測數(shù)據(jù)。分析各批供試品非共有峰面積是否合格。7、注射劑用中藥材指紋圖譜檢測標準（草案）書寫格式中藥材的名稱、來源供試品制備對照品溶液或內標物溶液的制備測定方法（包括儀器、試劑、測定條件和測定方法）指紋圖譜及各項技術參數(shù)起草說明三、中藥材指紋圖譜研究實例(一)肉蓯蓉藥材的指紋圖譜研究Lichrosorb250*4.6mm10μm（大連依利特公司Diamasil200*4.6mm5μm（迪馬公司）

Lichrospher250*4mm5μm(默克公司)1、色譜柱考察甲醇－水系統(tǒng)

乙腈－水系統(tǒng)0.095%磷酸乙腈-0.095%磷酸系統(tǒng)2、流動相考察3、檢測波長考察4、精密度試驗樣品12345相關系數(shù)(中位數(shù))0.99300.99280.98310.99290.99665、穩(wěn)定性試驗樣品0h2h4h8h16h24h相關系數(shù)中位數(shù)）0.99250.98540.99890.99270.98020.9988樣品12345相關系數(shù)（中位數(shù)）0.99760.99940.99340.99540.99696、重現(xiàn)性實驗荒漠肉蓯蓉管花肉蓯蓉沙蓯蓉鹽生肉蓯蓉不同產地管花肉蓯蓉C.tubulosa指紋圖譜不同寄主管花肉蓯蓉指紋圖譜相似度比較樣品中國檉柳甘蒙檉柳短穗檉柳細穗檉柳甘肅檉柳直立檉柳相似度0.99660.98580.98700.99910.99650.9380(二)白鮮皮藥材的指紋圖譜研究茵芋堿白鮮堿黃柏酮梣酮白鮮皮的對照指紋圖譜1、中藥白鮮皮指紋圖譜的建立特征區(qū)種內指紋區(qū)2、不同產地白鮮皮的指紋圖譜考察特征區(qū)種內指紋區(qū)白鮮皮根皮與木心部分指紋圖譜比較根皮木心3、不同藥用部位指紋圖譜的區(qū)別(三)紅花藥材的指紋圖譜研究紅花商品藥材指紋圖譜紅花商品藥材指紋123456紅花商品藥材指紋圖譜新疆產紅花指紋圖譜(四)黃芪藥材的指紋圖譜研究1、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱：十八烷基鍵合硅膠為填充劑，型號為Polaris5μC18-A250×4.6mm；檢測器：分別以蒸發(fā)光散射和紫外二種檢測器檢測，蒸發(fā)光散射檢測器采用法國SEDEX75型，蒸發(fā)溫度=40℃,氮氣壓力=2.2Bar，靈敏度=7，Units/Volt=2000；紫外檢測波長為280nm；柱溫：30℃；理論塔板數(shù)：按黃芪甲苷計，應不低于3000；進樣量：20ul；流動相：水－乙腈梯度洗脫時間(min)流速（ml/min）水(%)乙腈(%)01.0973401.07030651.01585701.01585751.0973標樣疊加圖芒柄花素苷異黃烷苷-1異黃烷苷-3毛蕊異黃酮黃芪甲苷芒柄花素毛蕊異黃酮苷黃芪藥材蒸發(fā)光散射檢測器檢測指紋圖譜黃芪藥材紫外檢測器(280nm)檢測指紋圖譜黃芪甲苷芒柄花素毛蕊異黃酮苷

芒柄花素苷

毛蕊異黃酮

甘肅黑龍江陜西其他河北山西內蒙古遼寧不同產地黃芪蒸發(fā)光散射檢測器檢測指紋圖譜比較不同產地黃芪藥材紫外檢測器檢測指紋圖譜比較陜西山西甘肅內蒙古黑龍江河北其他遼寧4、八個省50種藥材樣品指紋圖譜考察8個省50種藥材樣品的紫外檢測考察結果條形圖（毛蕊異黃酮苷峰面積）

8個省50種藥材皂苷類成分的考察圖譜（黃芪甲苷峰面積）

5、黃芪藥材ELSD檢測相似度結果6、黃芪藥材紫外檢測相似度結果7、黃芪藥材ELSD檢測重現(xiàn)性考察8、黃芪藥材紫外檢測重現(xiàn)性考察(五)柴胡藥材揮發(fā)油指紋圖譜研究柴胡藥材芳香水的GC對照指紋圖譜AgilentHP-5，30m×530mm×5mm

DB-WAX30×530mm×1mm

DB-62430×320mm×1.8mm

AgilentHP-5，30m×3200mm×0.25mm

色譜柱比較流速考察：上圖：柱流速0.8ml/min，中圖：1.0ml/min，下圖：1.5ml/min升溫程序考察：初始100℃3℃/min升至170℃，保持3min初始60℃，保持2min，3℃/min升至70℃，保持3min，5℃/min升至200℃，保持3min

初始40℃，保持2min，1℃/min升至50℃，保持2min，3℃/min升至70℃，保持3min,7℃/min升至220℃，保持3min

初始35℃，保持2min，1℃/min升至40℃，保持2min，3℃/min升至60℃，保持3min,7℃/min升至200℃，保持3min

穩(wěn)定性和精密度試驗重現(xiàn)性試驗河北易縣北柴胡野生

河北安國北柴胡

內蒙古喀喇沁旗錦山鎮(zhèn)南柴胡野生

山西省寧武縣南柴胡野生

北柴胡南柴胡栽培北柴胡栽培南柴胡第三部分中成藥指紋圖譜的建立供試品的制備方法測定方法、條件的考察中藥材、中間體、成品的相關性考察方法學考察：穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性試驗指紋圖譜的建立成品的穩(wěn)定性試驗中藥注射劑及其有效部位或

中間體指紋圖譜的檢測標準定義：中藥注射劑指紋圖譜系指中藥注射劑經適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示該注射劑特性的共有峰的圖譜。要求：以有效部位或中間體投料的中藥注射劑，還需制定有效部位或中間體的指紋圖譜。一、指紋圖譜的檢測標準內容：供試品和參照物的制備、檢測方法、指紋圖譜及技術參數(shù)。1、供試品的制備要求：根據(jù)注射劑、有效部位或中間體中所含化學成分的理化性質和檢測方法的需要，選擇適宜的方法進行制備。注意：制備方法必須確保該注射劑、有效部位或中間體主要化學成分在指紋圖譜中的再現(xiàn)。2、參照物的制備制定指紋圖譜必須設立參照物，應根據(jù)供試品中所含化學成分的性質，選擇適宜的對照品作為參照物；如果沒有適宜的對照品，可選擇適宜的內標物作為參照物。參照物的制備應根據(jù)檢測方法的需要，選擇適宜的方法。3.測定方法包括測定方法、儀器、試劑、測定條件等。應根據(jù)注射劑、有效部位和中間體所含化學成分的理化性質，選擇適宜的檢測方法。建議優(yōu)先考慮色譜方法。對于成分復雜的注射劑、有效部位和中間體，特別是復方中藥注射劑，必要時可以考慮采用多種檢測方法，建立多張指紋圖譜。制定指紋圖譜所采用的色譜柱、薄層板、試劑、測定條件等必須固定，采用光譜方法制定指紋圖譜，相應的測定條件也必須固定。4.指紋圖譜及技術參數(shù)(1)指紋圖譜根據(jù)供試品指紋圖譜的檢測結果，建立指紋圖譜。采用HPLC和GC制定指紋圖譜，根據(jù)樣品中所含成分的情況確定記錄時間；采用薄層掃描法制定指紋圖譜，必須提供從原點至溶劑前沿的圖譜；采用光譜法制定指紋圖譜，必須按各種光譜的相應規(guī)定提供全譜。對于化學成分類型復雜的中藥注射劑、有效部位和中間體，特別是中藥復方注射劑，必要時建立多張指紋圖譜。2.共有指紋峰的標定根據(jù)10批次以上供試品的檢測結果，標定共有指紋峰。色譜法采用相對保留時間標定指紋峰，光譜法采用波長或波數(shù)標定指紋峰。色譜峰的相對保留時間根據(jù)參照物的保留時間計算。3、指紋圖譜的評價以指紋圖譜相似度評價軟件評價以色譜峰面積的比值評價共有指紋峰面積的比值以對照品作為參照物的指紋圖譜，以參照物峰面積作為1，計算各共有指紋峰面積與參照物峰面積的比值；以內標物作為參照物的指紋圖譜，則以共有指紋峰中其中一個峰（要求峰面積相對較大、較穩(wěn)定的共有峰）的峰面積作為1，計算其他各共有指紋峰面積的比值。未達基線分離的共有峰，應計算該組峰的總峰面積作為峰面積，同時標定該組各峰的相對保留時間。以光譜方法制定指紋圖譜，參照色譜方法的相應要求執(zhí)行。峰面積比值的要求：保留時間小于或等于30分鐘的共有峰：Ai≥20％At：SD≤±20％；

20％At>Ai≥10％At：SD≤±25％；

10％At>Ai≥5％At：SD≤±30％；Ai<5％At：峰面積比值不作要求，但必須標定相對保留時間。保留時間超過30分鐘的共有峰：

Ai≥10％At：按上述規(guī)定執(zhí)行；

Ai<10％At：峰面積比值不作要求，但必須標定相對保留時間。非共有峰面積

供試品圖譜與指紋圖譜比較，非共有峰總面積不得大于總峰面積的5％。(5)中藥材、有效部位、中間體和注射劑指紋圖譜之間的相關性

為了確保制備工藝的科學性和穩(wěn)定性，應根據(jù)中藥材、有效部位、中間體和注射劑的指紋圖譜，標定各圖譜之間的相關性。二、起草說明目的在于說明制定檢測標準中各個項目的理由，規(guī)定各項目指標的依據(jù)、技術條件和注意事項等，既要有理論解釋，又要有實踐工作的總結及試驗數(shù)據(jù)。1、供試品的制備

應說明選用制備方法的依據(jù)。如供試品需要提取、純化，應考察提取溶劑、提取方法、純化方法等，提取、純化方法應力求最大限度地保留供試品中的化學成分。

2、參照物的制備

應說明參照物的選擇和試驗樣品制備的依據(jù)。應根據(jù)供試品中所含成分的性質，選擇適宜的對照品或內標物作為參照物。參照物的制備應根據(jù)檢測方法的需要，選擇適宜的方法進行，并說明制備理由。

3、檢測方法

根據(jù)供試品的特點和所含化學成分的理化性質選擇相應的檢測方法。應說明選擇檢測方法的依據(jù)和該檢測方法的原理，確定該檢測方法的方法學考察資料和相關圖（包括穩(wěn)定性、精密度和重現(xiàn)性）。對于所含成分類型較多的中藥注射劑、有效部位和中間體，特別是復方中藥注射劑，一種檢測方法或一張圖譜不能反映該注射劑、有效部位和中間體的固有特性，必要時可以考慮采用多種檢測方法或一種檢測方法的多種測定條件，制備多張指紋圖譜。制定指紋圖譜所采用的色譜柱、薄層板等必須固定廠家和型號、規(guī)格，試劑、測定條件等也必須相應固定。采用光譜法建立指紋圖譜，其相應的檢測條件也必須固定。穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性的考察方法和要求參見中藥材部分。

4、指紋圖譜及技術參數(shù)

(1)指紋圖譜

根據(jù)供試品圖譜所給出的相關參數(shù)，制定指紋圖譜，采用阿拉伯數(shù)字標示共有峰，用“S”標示參照物的峰。采用高效液相色譜法和氣相色譜法制定指紋圖譜，應提供2倍于對照指紋圖譜的記錄圖，以考察樣品中的主要成分是否全部出峰。提供建立對照指紋圖譜的有關數(shù)據(jù)，包括各共有峰的相對保留時間、各共有峰面積的比值。采用光譜方法建立的指紋圖譜，也必須提供相應的數(shù)據(jù)。

(2)共有指紋峰的標定

應根據(jù)10批次以上供試品圖譜的檢測結果，標定中藥注射劑、有效部位和中間體的共有指紋峰。說明標定共有指紋峰的理由，并附各批供試品圖譜。

(3)共有指紋峰面積的比值

應根據(jù)10批次以上供試品圖譜中共有指紋峰面積的比值，計算平均比值，列出各批供試品的檢測數(shù)據(jù)。

(4)非共有峰面積

計算10批次以上供試品圖譜中非共有峰面積及占總峰面積的百分比，列出各批供試品的檢測數(shù)據(jù)。

(5)中藥材、有效部位、中間體和注射劑指紋圖譜之間的相關性

應根據(jù)中藥材、有效部位、中間體和注射劑的指紋圖譜，標定各指紋圖譜之間的相關性。必要時可采用加入某一中藥材、有效部位或中間體的供試品或制備某一中藥材、有效部位或中間體陰性供試品的方法標定各指紋圖譜之間的相關性。提供相關性研究的指紋圖譜。

(6)中試產品的指紋圖譜申報臨床的中藥注射劑必須提供三批以上中試產品的指紋圖譜。申報生產的中藥注射劑必須提供十批以上中試產品的指紋圖譜。5、中藥注射劑指紋圖譜檢測標準（草案）書寫格式(1)供試品的制備(2)對照品溶液或內標物溶液的制備(3)測定方法（包括儀器、試劑、測定條件和測定方法）(4)指紋圖譜及各項技術參數(shù)(5)起草說明(6)有效部位或中間體的指紋圖譜檢測標準及起草說明三、中藥注射劑指紋圖譜研究實例

參芪注射液指紋圖譜的研究處方：黃芪、黨參黃芪藥材指紋圖譜十批黃芪指紋圖譜相似度結果黨參藥材指紋圖譜十批黨參指紋圖譜相似度結果參芪扶正注射液中間體指紋圖譜10批參芪扶正注射液中間體指紋圖譜相似度結果十批參芪扶正注射液指紋圖譜參芪扶正注射液指紋圖譜相似度結果黨參參芪中間體黃芪注射液黨參、黃芪——中間體——注射液相關性注射液中間體、黃芪和黨參提取液

的總離子流圖不同檢測波長下的指紋圖譜指紋圖譜中部分指紋峰的結構確證毛蕊異黃酮葡萄糖苷芒柄花素葡萄糖苷9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-葡萄糖苷tR＝31.446min毛蕊異黃酮葡萄糖苷

447:M+H469:M+Na915:2M+NaM=446

tR＝42.763min芒柄花素葡萄糖苷431:M+H453:M+Na883:2M+NaM=430第四部分指紋圖譜的其他作用一、指紋圖譜在黃芪注射液制備工藝統(tǒng)一中的作用8個廠家注射液皂苷成分不同企業(yè)生產注射液指紋圖譜比較(ELSD檢測)8個廠家注射液黃酮類成分不同企業(yè)生產注射液指紋圖譜比較(紫外檢測)根據(jù)三種制備工藝制備的注射液

紫外檢測指紋圖譜比較

藥材：山西渾源白：部頒標準紅：企業(yè)1黃：企業(yè)2根據(jù)三種制備工藝制備的注射液ELSD檢測指紋圖譜比較

藥材：山西渾源白：部頒標準紅：企業(yè)1黃：企業(yè)2二、柴胡注射液的指紋圖譜研究12個企業(yè)第一階段送檢樣品考察圖譜（1）

江西銀濤批號020920

河南新鄉(xiāng)新輝批號021010

焦作康華批號020705

西安黃河批號020828

12個企業(yè)第一階段送檢樣品考察圖譜（2）四川升和批號020822

昆明興中批號020307

河南百泉批號020703

廣東博羅先鋒批號020703

12個企業(yè)第一階段送檢樣品考察圖譜（3）山西晉新雙鶴批號0208192

河南浙川批號020602

四川升和滬醫(yī)批號020822

三九萬榮批號020607

研究單位采用三種制備工藝生