臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù)課件

臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù)

第三章1第一節(jié)光譜分析技術(shù)第二節(jié)電化學(xué)分析第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)第四節(jié)電泳技術(shù)第五節(jié)層析技術(shù)第六節(jié)離心技術(shù)第七節(jié)自動(dòng)生化分析技術(shù)

本章內(nèi)容概要2教學(xué)目標(biāo)和要求1、掌握分光光度技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。掌握電化學(xué)分析方法基本原理2、熟悉分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和操作方法光源檢查和波長(zhǎng)校正、原子分光光度計(jì)的類型和影響熒光分析的因素。熟悉離子選擇電極分類，離子選擇電極的分析方法3、了解其他光譜分析技術(shù)的基本原理及在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用。3一、光譜分析技術(shù)的基本原理：利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。1、光譜分析技術(shù)分類：發(fā)射光譜分析技術(shù)：火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法

吸收光譜分析技術(shù)：紫外、可見光分光光度法，原子吸收分光光度法和紅外光譜法

散射光譜分析技術(shù)：比濁法

5微粒性(E=hv)波粒二象性波動(dòng)性(=c/v)E=hv=hc/----光的能量與光的波長(zhǎng)成反比，與光的頻率成正比2、光的基本性質(zhì)---高速傳播的電磁波63、物質(zhì)對(duì)光吸收的基本原理：能量轉(zhuǎn)移----當(dāng)光輻射通過某種物質(zhì)時(shí)，組成該物質(zhì)的分子（原子）與光子發(fā)生“碰撞”，光子的能量因此轉(zhuǎn)移至分子（原子）上，使它們由基態(tài)(低能態(tài))躍遷到激發(fā)態(tài)(高能態(tài))，這種躍遷稱為激發(fā)。7能量釋放----處于較高能態(tài)的分子(激發(fā)態(tài)分子)不穩(wěn)定，當(dāng)其返回基態(tài)時(shí)，以熱或發(fā)射光譜的形式將能量釋放出來。所發(fā)射出的相應(yīng)光譜，稱分子發(fā)射光譜。9E1E0吸收光譜發(fā)射光譜激發(fā)態(tài)基態(tài)E1＞E010

（1）根據(jù)產(chǎn)生光譜的物質(zhì)結(jié)構(gòu)原子光譜(atomicspectrum)分子光譜(molecularspectrum)4.分類11②發(fā)射光譜(emissionspectrum)分析法：

根據(jù)物質(zhì)受到熱能或電能等的激發(fā)后所發(fā)射出的特征光譜來進(jìn)行定性及定量分析的一種方法。原子發(fā)射光譜法(atomicemissionphotometry)分子發(fā)光分析法13

1、定義：

根據(jù)被測(cè)物質(zhì)對(duì)各種不同波長(zhǎng)光的吸收能力，繪制吸收曲線，并根據(jù)曲線的特性鑒定物質(zhì)的方法。

屬光譜分析法。二分光光度法14可見光：400~700nm,有色物質(zhì)溶液紫外光：200~400nm,無色物質(zhì)153、應(yīng)用：（1）定性分析定性鑒定純度鑒定

結(jié)構(gòu)分析（2）定量分析17（一）光吸收的基本定律

1、定律：?jiǎn)紊馔ㄟ^吸光溶液后，吸光度與溶液的濃度和厚度之間呈正比關(guān)系。

18（1）Lambert定律：說明吸收與溶液液層厚度間的關(guān)系L1L2入射光透過光入射光透過光L2＞L1，I1＞I2I0I1I0I219

2、表達(dá)式：

-lgI/Io=-lgT=KLC

A=-lgT=KLC

I/Io為透光率(Transmittance,T)A為吸光度(Absorbance)K為吸光系數(shù)(absorptivity)L為液層厚度C為溶液濃度(concentration)摩爾吸光系數(shù)ε：當(dāng)溶液層厚度單位為cm，濃度單位為mol/L時(shí)，K即成為摩爾吸光系數(shù)21光源單色器樣品室檢測(cè)器顯示1.光源

在整個(gè)紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長(zhǎng)范圍在320～2500nm。紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。（二）分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)222.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長(zhǎng)單色光的光學(xué)系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。23（三）分光光度計(jì)的類型1.單光束

簡(jiǎn)單，價(jià)廉，適于在給定波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測(cè)器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束自動(dòng)記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測(cè)器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。253.雙波長(zhǎng)將不同波長(zhǎng)的兩束單色光(λ1、λ2)快束交替通過同一吸收池而后到達(dá)檢測(cè)器。產(chǎn)生交流信號(hào)。無需參比池?！?1～2nm。兩波長(zhǎng)同時(shí)掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。26Beckman紫外-可見分光光度計(jì)eppendorf紫外-可見分光光度計(jì)29（四）分光光度計(jì)的操作方法A.分光光度計(jì)的基本操作以721-A型分光光度計(jì)為例，其基本的操作步驟為：1.開721-A分光光度計(jì)的開關(guān)，將比色池的蓋子打開，通電20分鐘使儀器預(yù)熱。2.將波長(zhǎng)旋至測(cè)定的波長(zhǎng)。3.將空白液、校準(zhǔn)液或待測(cè)液放入比色池，將空白液置于光路中。4.將開關(guān)置于T位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細(xì)調(diào)調(diào)節(jié)T為0.0,關(guān)上比色池蓋子，調(diào)節(jié)T為100.0。5.將開關(guān)置于A，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)A為0.06.重復(fù)步驟4和57.將校準(zhǔn)液或待測(cè)液推入光路，測(cè)量溶液的吸光度（A）30B.吸光度的校正

鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計(jì)的吸光度。在25℃，將4mg鉻酸鉀溶于100ml的0.05mol/LKOH中，放入比色池中，在不同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校正表進(jìn)行比較，可檢測(cè)儀器吸光度的準(zhǔn)確度。31使用圖示 1.開啟電源，指示燈亮，儀器預(yù)熱10分鐘，選擇開關(guān)置于“T”。2.打開試樣室蓋（光門自動(dòng)關(guān)閉），調(diào)節(jié)“0%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”。323.將裝有溶液的比色皿放置比色架中。4.旋動(dòng)波長(zhǎng)手輪，把測(cè)試所需的波長(zhǎng)調(diào)節(jié)至刻度線處。335.蓋上樣品室蓋，將參比溶液比色皿置于光路，調(diào)節(jié)透過率“100%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“100.0T”（如果顯示不到100%T，則可適當(dāng)增加靈敏度的檔數(shù)，同時(shí)應(yīng)重復(fù)“2”，調(diào)整儀器的“00.0”）。 346.將參比溶液比色皿置于光路中，將選擇開關(guān)置于A，旋動(dòng)吸光度調(diào)零旋鈕，使得數(shù)字顯示為.000，然后移入被測(cè)溶液，顯示值即為試樣的吸光度A值。358．全部測(cè)定結(jié)束后，取出比色皿(洗凈)，關(guān)閉開關(guān).36三、分光光度技術(shù)的定性和定量方法（一）分光光度技術(shù)的定性方法定性依據(jù)：最大吸收波長(zhǎng)λmax和摩爾吸光系數(shù)ε2.摩爾吸光系數(shù)ε方法1.最大吸收波長(zhǎng)λmax方法37（二）分光光度技術(shù)的定量方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法

將一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照一定操作過程顯色后，分別測(cè)吸光度(A)，以A為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線(至少要5點(diǎn))。在相同條件下處理待測(cè)物質(zhì)并測(cè)定其吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線找出相對(duì)應(yīng)的濃度方法：38AXCXA（吸光度）C（濃度）39制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：（1）測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新繪制。（2）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。（3）當(dāng)待測(cè)液吸光度超過線性范圍時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測(cè)定。（4）標(biāo)本測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的條件完全一致。402．比較法

CX=(AX×Cs)/As己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為：其中Cx和Ax為標(biāo)本管濃度和吸光度，Cs和As分別為標(biāo)準(zhǔn)管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量和標(biāo)本管濃度相近。413．其它分析方法包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析等方法。42四、其它光譜分析技術(shù)（一）火焰光度法（二）原子吸收分光光度法（三）熒光光度分析法1．基本原理2．組成1．基本原理2．組成3．原子吸收分光光度法的特點(diǎn)

3．熒光光度定量分析法4．熒光光度分析技術(shù)的應(yīng)用1．基本原理2．影響熒光強(qiáng)度的因素43火焰光度法——等離子體發(fā)射光譜法44原子吸收分光光度法45熒光光度法NanoDrop?ND-3300Fluorospectrometer

46第二節(jié)電化學(xué)分析電化學(xué)分析方法基本原理離子選擇電極分類離子選擇電極的分析方法47電化學(xué)分析是利用物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)，測(cè)定化學(xué)電池電位、電流或電量的變化進(jìn)行分析的方法。電化學(xué)分析方法電位分析法：測(cè)定原電池電動(dòng)勢(shì)以求物質(zhì)含量的分析方法電導(dǎo)法：通過電阻測(cè)定以求物質(zhì)含量的分析方法電容量分析法：借助某些物理量的突變作為分析重點(diǎn)的指示48電位分析法是利用電極電位和濃度之間的關(guān)系來確定物質(zhì)含量的分析方法。一、電化學(xué)分析方法基本原理原電池是利用兩個(gè)電極之間金屬性的不同,產(chǎn)生電勢(shì)差,從而使電子的流動(dòng),產(chǎn)生電流.又稱非蓄電池，是電化電池的一種。49電池電動(dòng)勢(shì)和電極電勢(shì)電池電動(dòng)勢(shì)：將電位差計(jì)接在電池的兩個(gè)電極之間而直接測(cè)得的電勢(shì)值習(xí)慣上稱之為電池的電動(dòng)勢(shì)電極電勢(shì)：當(dāng)采用相對(duì)電勢(shì)法時(shí)，系用一定的參比電極與研究電極組成電池，這一電池的電動(dòng)勢(shì)稱為相對(duì)于給定參比電極而確定的研究電極電勢(shì)。(金屬和溶液相接觸的內(nèi)電位差即為金屬電極和溶液間的電極電勢(shì))所謂“電極/溶液”之間的絕對(duì)電勢(shì)不但無法直接測(cè)量，在處理電極過程動(dòng)力學(xué)問題時(shí)也不需要用到它。在計(jì)算電池電動(dòng)勢(shì)時(shí)，也完全可以采用相對(duì)電極電勢(shì)來代替絕對(duì)電極電勢(shì)。50Theabsolutepotentialdifferenceacrossasingleelectrifiedinterfacecannotbemeasured!Itisnotnecessarytoknowexactvalueofitbutthedifferenceofabsolutepotentialdifferenceisimportantforelectrochemists!單個(gè)界面上的絕對(duì)電位是不可測(cè)的，對(duì)于電化學(xué)研究重要的是其差值51參比電極顧名思義，參比電極是給出一個(gè)固定的值，其它的電極電勢(shì)的測(cè)量以此為基礎(chǔ)。一個(gè)好的參比電極應(yīng)該不受溫度、時(shí)間和通過小電流而變化,應(yīng)遵守Nernst方程。指示電極指示電極的電位隨離子濃度而變化，能指示待測(cè)離子濃度。52二離子選擇性電極1、定義：離子選擇性電極是一種以電位法測(cè)定某些特定離子活度的指示電極。2、特點(diǎn)：電極的關(guān)鍵部件敏感膜對(duì)溶液中特定離子有選擇性響應(yīng)。敏感膜并不給出或得到電子，而是選擇性地讓某些離子滲透，同時(shí)包含離子交換過程3、測(cè)定原理：基于內(nèi)部溶液與外部溶液之間產(chǎn)生的電位差，即膜內(nèi)外被測(cè)離子活度的不同而產(chǎn)生電位差，稱之為膜電位。53544、離子選擇性電極分類原電極（主體電極）晶體膜電極非晶體膜電極單晶膜電極多晶膜電極如：各種玻璃電極、液態(tài)膜電極如：氟電極如：氯電極（Agcl+Ag2S）敏化電極氣敏電極酶電極其它如NH3電極SO2電極等如尿素酶電極等細(xì)菌電極生物電極免疫電極等按國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）建議分類555、離子選擇性電極的基本構(gòu)造膜電極的構(gòu)成1、電極桿（玻璃或塑料管）2、內(nèi)參比電極（銀－氯化銀）3、內(nèi)參比溶液4、敏感膜（關(guān)鍵部件）56（一）非晶膜電極—玻璃電極

內(nèi)參比電極：Ag—AgCl電極。玻璃泡：敏感膜內(nèi)參比溶液：pH一定的緩沖溶液。1玻璃電極的結(jié)構(gòu)三常用的離子選擇性電極57（2）玻璃電極及膜電位：玻璃電極是最早使用的離子選擇性電極。玻璃薄膜是決定電極性能的最重要組成部份。內(nèi)參比電極的電位是恒定的，與被測(cè)溶液的PH無關(guān)。玻璃電極用作測(cè)PH的指示電極，是因?yàn)榭缭讲Ａぎa(chǎn)生了膜電位。膜電位與待測(cè)溶液PH值有關(guān)。58在任意溫度T下：

根據(jù)此公式，通過測(cè)定玻璃電極的電極電位，可求出膜外試液的H+活度。這是使用玻璃電極測(cè)量pH的理論根據(jù)和基本計(jì)算關(guān)系。

593.玻璃電極的優(yōu)點(diǎn)選擇性高：膜電位的產(chǎn)生不是電子的得失。其它離子不能進(jìn)入敏感膜產(chǎn)生交換。當(dāng)溶液中Na+濃度比H+濃度高1015倍時(shí)，兩者才產(chǎn)生相同的電位；不受溶液中氧化劑、還原劑、顏色、沉淀及膠體、雜質(zhì)的影響，不易中毒；改變玻璃膜的組成，可制成對(duì)其它陽離子響應(yīng)的玻璃膜電極。60（二）氣敏電極

氣敏電極端部裝有透氣膜，氣體可通過它進(jìn)人管內(nèi)。管內(nèi)插入pH玻璃復(fù)合電極，復(fù)合電極是將外多比電極（Ag／AgCI）繞在電極周圍。管中充有電解液，也稱中介液。試樣中的氣體通過透氣膜進(jìn)入中介液，引起電解液中離子活度的變化，這種變化由復(fù)合電極進(jìn)行檢測(cè)。如CO2氣敏電極，用PH玻璃電極作為指示電極，中介液為0.01mol/L的碳酸氫鈉。二氧化碳與水作用生成碳酸，從而影響碳酸氫鈉的電離平衡來指示CO2。61該類電極其實(shí)是一種復(fù)合電極：將pH玻璃電極和指示電極插入中介