第八章分子發(fā)光分析法

第八章分子發(fā)光分析法Molecular

Luminescence

Analysis樊雪梅商洛學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系18.1概述2分類：按激發(fā)的模式分類

分子發(fā)光熒光光致發(fā)光磷光

化學(xué)發(fā)光/生物發(fā)光什么叫分子發(fā)光分析法呢？——以分子發(fā)光作為檢測(cè)手段的分析方法稱為分子發(fā)光分析法。8.2分子熒光與磷光8.2.1基本原理1.熒光、磷光產(chǎn)生的機(jī)理(1)熒光、磷光的產(chǎn)生3

在一般溫度下，大多數(shù)分子處在基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。處于基態(tài)的分子吸收能量(電能、熱能、化學(xué)能或光能等)后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)是很不穩(wěn)定的，它將很快地釋放出能量又重新躍遷回基態(tài)。若分子返回基態(tài)時(shí)以發(fā)射電磁輻射(即光)的形式釋放能量，就稱為“發(fā)光”。如果物質(zhì)的分子吸收了光能而被激發(fā)，躍遷回基態(tài)所發(fā)射的電磁輻射，稱為熒光和磷光。4●

分子中同一軌道的兩個(gè)電子自旋方向相反，即自旋配對(duì)。若分子中所有電子都是自旋配對(duì)的，該分子便處于單重態(tài)，用符號(hào)S表示?！?/p>

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)●

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1●大多數(shù)有機(jī)化合物分子的基態(tài)都處于單重態(tài)。5●

基態(tài)分子（S0）吸收能量后，若電子在躍遷過(guò)程中不發(fā)生自旋方向的變化，分子處于激發(fā)的單重態(tài)，第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)用S1、S2、S3......表示?！衿叫凶孕瘸蓪?duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低●如果電子在躍遷過(guò)程中伴隨著自旋方向的變化，這時(shí)分子中便具有兩個(gè)自旋不配對(duì)的電子，分子處于激發(fā)的三重態(tài)，用符號(hào)T表示。第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1

、T2…傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)化外轉(zhuǎn)移系間竄越振動(dòng)弛豫無(wú)輻射躍遷

處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無(wú)輻射躍遷方式回到基態(tài)。振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。內(nèi)轉(zhuǎn)化：同多重態(tài)電子能級(jí)中,等能級(jí)間的能級(jí)交換。外轉(zhuǎn)移：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷。系間竄越：不同多重態(tài)，有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷?！穹禽椛淠芰總鬟f過(guò)程●輻射能量傳遞過(guò)程

熒光：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)(S1→S0)。

發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長(zhǎng)長(zhǎng)。λ發(fā)射>λ吸收磷光：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)(T1→S0)；電子由S0進(jìn)入T1的可能過(guò)程：

S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動(dòng)弛豫→T1

S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫熒光與磷光的區(qū)別：(1)熒光是由激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的；而磷光是由激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的。(2)熒光時(shí)間短，磷光時(shí)間長(zhǎng)。(2)熒光、磷光的壽命和量子產(chǎn)率a.

熒光、磷光的壽命分子在激發(fā)態(tài)的平均時(shí)間。對(duì)于處于S1(T1)電子態(tài)的熒光體來(lái)說(shuō)，其平均壽命()

可表示為：kF(P)--熒光（磷光）發(fā)射過(guò)程中的速率常數(shù)。ki--各種分子內(nèi)非輻射衰變過(guò)程的速率常數(shù)總和。b.

熒光、磷光的量子產(chǎn)率kF、kp主要取決與熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)；

ki主要取決與化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與熒光物質(zhì)的分子

結(jié)構(gòu)有關(guān)。st系間竄躍效率。大多數(shù)熒光物質(zhì)的量子產(chǎn)率在0.1~1之間。例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F(xiàn)

=

0.55；熒光素F

=

12.熒光、磷光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系(1)分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件a:具有合適的結(jié)構(gòu)；b:具有一定的熒光量子產(chǎn)率。

熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過(guò)程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過(guò)程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。(2)熒光與有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)a.躍遷的類型π*

→π

π*→n

對(duì)于有機(jī)熒光物質(zhì):

n→π*

εmax＜100平均壽命10-5~10-7sπ→π*

εmax≥104平均壽命10-7~10-9skS→T小π*→π

是有機(jī)化合物產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。苯萘蒽

λexmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52共軛效應(yīng)使熒光增強(qiáng)的原因：主要是由于增大熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)，有利于產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子，從而有利于熒光的發(fā)生。產(chǎn)生熒光的有機(jī)物質(zhì)，都含有共軛雙鍵，共軛體系越大，離域大π鍵的電子越易激發(fā)，熒光與磷光越易產(chǎn)生。b.

共軛效應(yīng)c.剛性平面結(jié)構(gòu)芴

F=1聯(lián)苯

F=0.2

熒光物質(zhì)的剛性和平面性增加，有利于熒光發(fā)射。原因：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，也就減少了碰撞去活的可能性?！狧N2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN產(chǎn)生p→π共軛化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345熒光強(qiáng)度1018202020d.取代基效應(yīng)●

給電子取代劑加強(qiáng)熒光●

得電子取代基減弱熒光、加強(qiáng)磷光—C=0，—COOH，—NO2不產(chǎn)生

p→π共軛硝基苯：不產(chǎn)生熒光、弱磷光二苯甲酮：弱熒光、強(qiáng)磷光空間位阻對(duì)熒光發(fā)射的影響●

取代基的位置反式二苯乙烯強(qiáng)熒光物質(zhì)F=0.75F=0.03異構(gòu)體對(duì)熒光發(fā)射的影響順式二苯乙烯非熒光物質(zhì)●

重原子取代基效應(yīng)（-Cl，-Br，

-I）

S1→T1的系間竄躍由于重原子的存在而增強(qiáng)。含有重原子的溶劑，重原子效應(yīng)使得熒光強(qiáng)度減弱、磷光強(qiáng)度增強(qiáng)。3.影響分子發(fā)光的環(huán)境因素(1)溶劑的影響溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都會(huì)影響熒光強(qiáng)度。(2)溫度的影響溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，熒光強(qiáng)度減弱。(3)溶液pH的影響

對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制。OH-H+OH-H+pH=1,有熒光pH=13,無(wú)熒光無(wú)熒光有熒光4.金屬螯合物的熒光除過(guò)渡元素的順磁性原子會(huì)發(fā)生線狀熒光光譜外，大多數(shù)無(wú)機(jī)鹽類金屬離子，在溶液中只能發(fā)生無(wú)輻射躍遷，因而不產(chǎn)生熒光。但是，在某些情況下，金屬螯合物卻能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，并可用于痕量金屬元素分析。

不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結(jié)構(gòu)，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強(qiáng)，平面結(jié)構(gòu)的增大，常會(huì)發(fā)生熒光。8-羥基喹啉弱熒光8-羥基喹啉-Zn螯合，黃綠色，強(qiáng)熒光(1)螯合物中配位體的發(fā)光(2)螯合物中金屬離子的特征熒光

這類發(fā)光過(guò)程通常是螯合物首先通過(guò)配位體的躍遷激發(fā)，接著配位體把能量轉(zhuǎn)給金屬離子，導(dǎo)致dd躍遷和ff躍遷，最終發(fā)射的是dd躍遷和ff躍遷光譜。S0S1d*、f*系間竄躍分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移

d*→df*→f熒光T15.熒光、磷光的猝滅熒光猝滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或消失的現(xiàn)象。熒光猝滅劑：這些溶劑分子或其它溶質(zhì)分子稱為熒光

猝滅劑。(1)

碰撞猝滅

指處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞，使激發(fā)單重態(tài)的熒光分子以無(wú)輻射躍遷的方式回到基態(tài)，產(chǎn)生猝滅作用。(3)生成化合物的猝滅(靜態(tài)猝滅)(2)

能量轉(zhuǎn)移猝滅指基態(tài)的熒光物質(zhì)與猝滅劑反應(yīng)生成非熒光的化合物，導(dǎo)致熒光的猝滅。

氧分子是熒光、磷光的猝滅劑。有人認(rèn)為是由于三重態(tài)的氧分子和激發(fā)單重態(tài)的熒光分子相互作用形成激發(fā)單重態(tài)的氧分子和激發(fā)三重態(tài)的熒光分子所引起的。(4)氧的猝滅作用

也有人認(rèn)為氧和其它順磁性的物質(zhì)一樣，它們之所以會(huì)使熒光猝滅，是由于它們能夠促進(jìn)激發(fā)單重態(tài)的熒光分子的系間跨躍；還有的認(rèn)為熒光猝滅是由于熒光物質(zhì)受到氧化的緣故。(5)自猝滅與自吸收當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度大于1g/L時(shí)，常發(fā)生熒光的自猝滅。自吸收：形成二聚體：有的二聚體使熒光強(qiáng)度降低甚至不發(fā)熒光。6.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長(zhǎng)如何選擇？(1)熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線

固定發(fā)射波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),做熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線圖。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大。

激發(fā)光譜與紫外-可見(jiàn)吸收光譜類似。(2)熒光光譜(或磷光光譜)固定em=

620nm(MAX)ex=290nm(MAX)固定最大激發(fā)波長(zhǎng),做熒光(或磷光)強(qiáng)度與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線。(3)

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a.

Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光。c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜(與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→

31

→21

→17.熒光（或磷光）強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系

熒光強(qiáng)度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產(chǎn)率。

If

=

Ia又根據(jù)Beer定律：Ia=I0-It=I0(1-e-

b

c)I0和It分別是入射光強(qiáng)度和透射光強(qiáng)度。代入上式得：

If=I0(1-e-

bc)=

I0(1-e-2.3

bc)整理得：If

=2.3I0bc當(dāng)入射光強(qiáng)度I0和b一定時(shí)，上式為:

If=Kc

這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液中，當(dāng)bc<0.05時(shí)才成立。對(duì)于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度和濃度不呈線性關(guān)系。同理：

IP=Kc

主要組成部件光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器發(fā)射單色器8.2.2熒光、磷光分析儀器

由光源發(fā)射的光經(jīng)第一單色器得到所需的激發(fā)光波長(zhǎng)，通過(guò)樣品池后，一部分光能被熒光物質(zhì)所吸收，熒光物質(zhì)被激發(fā)后，發(fā)射熒光。為了消除入射光和散射光的影響,熒光的測(cè)量通常在與激發(fā)光成直角的方向上進(jìn)行。為消除可能共存的其它光線的干擾，如由激發(fā)所產(chǎn)生的反射光、Raman光以及為將溶液中雜質(zhì)濾去，以獲得所需的熒光，在樣品池和檢測(cè)器之間設(shè)置了第二單色器。熒光作用于檢測(cè)器上，得到響應(yīng)的電信號(hào)。1.激發(fā)光源

在紫外-可見(jiàn)區(qū)范圍，通常的光源是氙燈和高壓汞燈。2.樣品池

通常用石英，形狀以方形和長(zhǎng)方形為宜。3.單色器光柵4.檢測(cè)器由光電管和光電倍增管作檢測(cè)器，并與激發(fā)光成直角。問(wèn)題：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)與熒光分光光度計(jì)有什么區(qū)別？光源樣品池單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器I0ItI0ItIF,p紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：兩面透光熒光分光光度計(jì)：四面透光8.2.3熒光分析法的應(yīng)用1.無(wú)機(jī)化合物

在紫外光照射下會(huì)發(fā)生熒光的無(wú)機(jī)化合物很少，主要依賴于有機(jī)試劑形成的螯合物。(1)直接熒光測(cè)定法自從1867年Goppelsroder進(jìn)行了歷史上首次的熒光分析工作，應(yīng)用鋁—桑色素配合物的熒光進(jìn)行鋁的測(cè)定以來(lái)，采用有機(jī)試劑可以測(cè)定70多種元素。其中，較常測(cè)定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd與某些稀土元素。某些元素雖然不與有機(jī)試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是它會(huì)與發(fā)熒光的配合物爭(zhēng)奪配位體，組成不發(fā)熒光的配合，使其產(chǎn)生熒光熄滅，由熒光熄滅的強(qiáng)度可測(cè)定該元素的含量。(2)熒光熄滅測(cè)定法較常測(cè)定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、

Mo、W等。(3)催化熒光測(cè)定法某些元素雖然與有機(jī)試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是反應(yīng)速度慢，在某些微量元素的催化下，反應(yīng)速度會(huì)加快，在特定的時(shí)間內(nèi)可用來(lái)測(cè)定微量元素。某些微量元素存在，會(huì)催化發(fā)熒光的配合物產(chǎn)生熒光熄滅，在特定的時(shí)間內(nèi)可用來(lái)測(cè)定微量元素。常測(cè)定的元素有：Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、

Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H2O2、CN2.有機(jī)化合物芳香族化合物存在共軛的不飽和體系，是有機(jī)化合物熒光測(cè)定的主要類型。待測(cè)物試劑λexmaxλemmax測(cè)定范圍ppm丙三醇苯胺紫外藍(lán)色0.1~2糠醛蒽酮4655051.5~15氨基酸氧化酶3154250.01~50維生素A無(wú)水乙醇3454900~20蛋白質(zhì)曙紅丫紫外5400.06~6腎上腺素乙二胺4205250.001~0.02青霉素α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮雜蒽4205000.0625~0.625玻璃酸梅3-乙酰氧基吲哚3954700.001~0.033胍基丁胺鄰苯二醛3654700.05~5四氧嘧啶苯二胺36548510-48.3化學(xué)發(fā)光分析法8.3.1

概述

某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，由于吸收了反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，便發(fā)出一定波長(zhǎng)的光。這種吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過(guò)程稱為化學(xué)發(fā)光。利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)而建立起來(lái)的分析方法稱為化學(xué)發(fā)光分析法?；瘜W(xué)發(fā)光也發(fā)生于生命體系，這種發(fā)光稱為生物發(fā)光。在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長(zhǎng)的光。

A+B=C+D*D*→D+h化學(xué)反應(yīng)必須滿足如下條件：(1)化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能，激發(fā)能主要來(lái)源于

反應(yīng)焓。(2)要有有利的化學(xué)反應(yīng)歷程，使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能

被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)。(3)激發(fā)態(tài)能釋放光子或能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個(gè)分，

而使該分子激發(fā)，然后以輻射光子的形式回到基態(tài)。8.3.2

基本原理1.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)化學(xué)效率：發(fā)光效率：時(shí)刻t的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù))：dc/dt分析物參加反應(yīng)的速率。2.化學(xué)發(fā)光效率8.3.3化學(xué)發(fā)光的類型1.

直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光(1)直接化學(xué)發(fā)光指被測(cè)物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。A+BC*+DC*C+h式中A或B是被測(cè)物，通過(guò)反應(yīng)生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C*，當(dāng)C*躍遷回基態(tài)時(shí)，輻射光子。(2)間接發(fā)光是被測(cè)物A或B，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)生成初始激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C*，C*不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給F