天然產(chǎn)物提取技術

天然產(chǎn)物的提取技術進入中試前的考慮：1.產(chǎn)率達到一定的穩(wěn)定程度，質量可靠；2.工藝路線及操作步驟確定，建立和確定產(chǎn)品、中間體及原料的分析方法；3.確定和鑒定產(chǎn)品的生物材料的資源；天然產(chǎn)物提取中試設計進入中試前的考慮：3.確定和鑒定產(chǎn)品的生物材料的資源；4.物料的衡算，“三廢”的處理方法；5.中試規(guī)模及原料的規(guī)格和數(shù)量；6.安全生產(chǎn)措施和方法。天然產(chǎn)物提取中試設計天然產(chǎn)物提取中試放大工藝特點：中試放大是由小試轉入工業(yè)化生產(chǎn)的過渡性研究工作，對小試工藝能否成功地進入規(guī)模生產(chǎn)至關重要研究工作主要圍繞著如何提高收率、改進操作、提高質量、形成生產(chǎn)等方面進行。一個工藝研究項目的最終目的是能在生產(chǎn)上采用。1.原輔材料規(guī)格的過渡試驗；小試時：一般采用的原輔材料規(guī)格較高。

目的：是為了排除原料中所含雜質的不良影響，確保實驗的準確性。大規(guī)模生產(chǎn)時：應改為生產(chǎn)時容易獲得的原輔材料進行過渡性實驗。轉入中試放大生產(chǎn)的過渡性試驗：2.設備選型與材料質量試驗；小試階段：大部分實驗時在小型玻璃儀器中進行；中試階段：要對設備材料的質量和設備的選型進行實驗，為工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)。轉入中試放大生產(chǎn)的過渡性試驗：3.反應條件限度實驗；目的:找到最適宜的工藝條件（如培養(yǎng)基種類、反應溫度、壓力、pH等），一般均勻一個許可范圍。轉入中試放大生產(chǎn)的過渡性試驗：4.原輔材料、中間體及產(chǎn)品質量分析方法研究

中間體和新產(chǎn)品均無現(xiàn)成分析方法，須研究他們的鑒定方法，制定簡便易行、準確可靠的檢驗方法。轉入中試放大生產(chǎn)的過渡性試驗：5.下游工藝研究

上游工藝：以生物材料資源生產(chǎn)為核心的研究內容；下游工藝：以產(chǎn)品的后處理為研究內容的操作。

必須研究盡量簡化下游工藝操作，采用新工藝、新技術和新設備，提高勞動生產(chǎn)率，降低成本。轉入中試放大生產(chǎn)的過渡性試驗：中試放大的方法：

1.經(jīng)驗法：2.相似法：3.數(shù)學模型法中試放大的研究主要內容：1.工藝路線和各步反應方法的最后確定；2.設備材質和型號的選擇；3.反應器的規(guī)模選擇和反應攪拌器型式與攪拌速度的考察；4.生產(chǎn)反應條件的研究；5.工藝流程和操作方法的確定；中試放大的研究主要內容：6.物料衡算；7.安全生產(chǎn)與“三廢”防治措施；8.原輔材料、中間體的物理性質和化工常數(shù)的測定；9.原輔材料、中間體質量標準的研究制定；10.消耗定額、原料成本、操作工時與生產(chǎn)周期等的計算。第二節(jié)原料細胞結構與提取工藝特性一、原料與天然產(chǎn)物提取工藝特性1.植物材料：根、莖、干果、花、葉等

根：如人參、丹參等用有機溶劑乙醇浸出；莖:可用有機溶劑加熱浸出干果：可用有機溶劑浸出花：是由果膠類物質組成，需用酶或發(fā)酵的方法處理后再用溶劑提?。蝗~：多數(shù)不用處理，直接用溶劑提取；2.動物材料與天然產(chǎn)物提取工藝特性角類和骨類：加工前需要粉碎細一些；皮類：應用新鮮材料，加工前先破碎；3.海洋生物材料與天然產(chǎn)物提取工藝特性

海藻：抗腫瘤、防心血管疾病等；腔腸動物：?？舅?；軟體動物：抗病毒、抗腫瘤等；棘皮動物：海膽毒素；4.微生物與天然產(chǎn)物提取工藝特性

細菌放線菌藍細菌真菌（霉菌和酵母菌）二、生物細胞的結構與天然成分的浸出

活性成分或有效成分存在細胞質中。

細胞有：細胞壁和細胞膜細胞有細胞壁和細胞膜；細胞膜類似于半透膜，具有超濾作用，即對細胞外的物質的透過有分子篩作用，篩孔有一定的大小，透過物質的分子較小時容易透過，較大的分子不易透過；活性成分/有效成分是存在細胞質中細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠物質組成，細胞壁上有許多小孔叫孔壁，不過，不影響水溶性物質的出入；對外界物質的進入或細胞內物質的外出有決定作用的是細胞膜。活性成分/有效成分是存在細胞質中植物原料外表面如葉、果實皮、莖皮等的表面組織上有蠟浸細胞壁，是蠟浸入細胞的纖維素壁中，形成蠟層。蠟層是由蠟醇和脂肪酸組成，使得細胞壁有很強的疏水性。有效成分的提取，要設法破壞一般細胞的細胞膜，改變細胞膜的通透性，使浸出溶劑進入細胞內，并把有效成分提取出來。對有蠟浸細胞壁組織表面的原料需破壞其蠟浸細胞壁，改變細胞壁的通透性。二、生物細胞的結構與天然成分的浸出

活性成分或有效成分存在細胞質中。

破壞細胞膜和細胞壁，

使有效成分提取出來。三、破壞細胞壁和細胞膜的方法1.風干法2.加熱干燥法3.機械法4.非機械法5.化學法

在通風良好不見直射陽光的條件下開始時，由于外界空氣的蒸汽壓或相對濕度較低，細胞壁先失水，隨后細胞質的液泡也失水，細胞液的濃度增高，使?jié)q壓減低萎蔫，終致細胞破壞到死亡。失水收縮，但不產(chǎn)生質壁分離，是機械傷害。改變膜的超濾性和滲透性，細胞內的物質易于被溶劑浸出。風干法，對有效成分損害??；1.風干法原料的細胞組織用風干法不易破壞的，且有效成分在加熱時沒有重大影響的條件下，可用加熱法破壞原料組織結構；a.在浸出有效成分時，使細胞質和蛋白質凝集、變性、收縮，致使細胞膜和細胞壁破壞，提高滲透性，細胞內物質迅速向外擴散；2.加熱干燥法b.新鮮原料切片后加熱干燥，水分急劇蒸發(fā)，細胞內原生質和蛋白質凝固、變性、細胞萎縮，破壞細胞壁和細胞膜，改變細胞組織的滲透性；不適合熱不穩(wěn)定性物質；2.加熱干燥法處理量大，速度快，但需采取冷卻措施。a.球磨法:將細胞組織懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使細胞破碎；b.高壓勻漿：利用高壓迫使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊而造成細胞破裂；壓力、溫度和通過勻漿閥的次數(shù)；3.機械法：處理量大，速度快，但需采取冷卻措施。c.X-press法：改進的高壓方法；d.超聲波法：在15－25KHz頻率下操作，利用超聲波的空穴作用，不適用于大規(guī)模操作；3.機械法：適于微生物的破碎，包括酶解、滲透壓沖擊、凍結和融化、熱處理和化學法溶胞等；酶解：利用酶的反應分解破壞細胞壁上特殊的鍵，達到破壞目的，有專一性強，條件溫和的優(yōu)點；滲透壓沖擊：滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內，引起細胞壁破裂；適用于細胞壁較脆弱的菌；凍結和融化：在低溫下突然冷凍和室溫下融化，對此達到破壞細胞壁作用；適合細胞壁較弱的胞體；4.非機械法如：酸堿及表面活性劑處理；可以使蛋白質水解、細胞溶解或使某些組分從細胞內提取出來；脂溶性溶劑也可用于化學處理，如丁醇、丙酮、氯仿等；但這些溶劑常易引起生化物質破壞，同時還帶來分離和回收化學物質的問題。5.化學法三、破壞細胞壁和細胞膜的方法選擇合適的破碎方法，考慮下列因素：細胞的數(shù)量；所需要的產(chǎn)物對破碎條件的敏感性如：溫度、化學試劑、酶等的敏感性；達到的破碎程度及破碎所需的速度等；盡可能采用溫和的方法。1.形態(tài)與性狀相結合的鑒別方法：按生物分類學形態(tài)鑒定的方法，依照各部分的形態(tài)，確定其所屬分類學的科、屬、種；再按其利用部位進行形態(tài)學與性狀鑒定相結合的方法，做出鑒定結論。四、原料的質量控制2.顯微粉末鑒定：在顯微鏡下觀察其組織或細微的形態(tài)，做出鑒定結論；3.化學鑒別法：根據(jù)被鑒定原料的化學成分，利用TLC法或傳統(tǒng)化學方法進行成分鑒定

四、原料的質量控制4.紫外光譜法：原料可用乙醇或甲醇浸出液在紫外光譜儀上測定紫外光譜；可靠、簡單；四、原料的質量控制5.有效成分的含量測定：GC：分析和鑒定各成分，且同時確定定性和定量的結果，適用于芳香油、香豆素、脂肪酸等；四、原料的質量控制5.有效成分的含量測定：HPLC：分離效果更好的分析方法，比GC還要廣泛，比TLC分離效果更好；需要儀器設備－高壓液相色譜儀；紫外吸收光譜掃描；既可以定性分析，又可以定量分析且結果較為理想。四、原料的質量控制五、原料的前處理原料前處理的依據(jù)，要根據(jù):原料組織的化學成分、有效成分的性質和生物化學的性質、原料的組織和細胞結構進行處理。1.除雜、洗滌、切割:需要在新鮮狀態(tài)進行除雜和洗滌，原料處理按生產(chǎn)工藝的要求，選擇采收原料的時間，制定除雜方法；五、原料的前處理2.原料的干燥：破壞細胞壁和細胞膜，利于浸出目的是為了便于貯藏和運輸，有破壞細胞膜和細胞壁的作用，利于浸出的順利進行；需采用不同的干燥方法進行干燥；

2.原料的干燥：例如：對熱不穩(wěn)定性的藥材，多用風干法。中藥材多用曬干法，在日光的直接照射下，干燥速度較快、細胞膜破壞較好，但不適合光不穩(wěn)定性的有效成分的干燥；如：小檗根，含有雙卞基異喹啉生物堿，對光不穩(wěn)定，易發(fā)生結構改變，不適用于曬干法，適合風干法干燥。目的：增加原料的表面積，提高浸出速度。原料的粉碎程度同原料的種類和性質相關：草類原料，粉碎粗一些；木質類原料，粉碎細一些；較粗的根、莖和果實以及種子類原料，需粉碎的更細。3.粉碎：4.發(fā)酵和水解處理法：5.脫脂處理：原料中含較多的油、脂或蠟6.含揮發(fā)油類原料的處理：

宜在新鮮狀態(tài)處理，防止成分改變；7.以酶和蛋白質為主要成分的原料處理：同6，需在新鮮狀態(tài)處理，以免變性或失活。六、生理活性物質的保護措施對一些生物大分子如蛋白質、酶和核酸，主要的保護措施：1.緩沖系統(tǒng)：如磷酸鹽溶液、檸檬酸溶液等；

目的是防止提取過程中某些酸堿基團的解離，造成活性物質的變性；2.加入保護劑：防止某些生理活性物質基團和酶的活性中心收到破壞。3.抑制水解酶的破壞4.其他一些特殊要求的保護第三節(jié)天然產(chǎn)物傳統(tǒng)分離純化方法提取法萃取法微波提取超聲波提取過濾蒸發(fā)濃縮沉淀法結晶干燥一、提取法1.提?。海ㄓ址Q浸出、固液萃?。?/p>

是應用有機或無機溶劑將固體原料中的可溶性組分溶解，使其進入液相，再將不溶性固體和溶液分開的操作。溶質：提取原料的可溶性組分；溶劑：用于溶解溶質的液體，或稱提取劑。一、提取法1.提取：（浸出、固液萃?。?/p>

溶劑提取法根據(jù)植物中各種有效成分在溶劑中的溶解作用，選用對有效成分溶解度大，對不需要成分溶解度小的溶劑，而將有效成分從植物組織內提取出來。提取所得的含有溶質的溶液稱為溢流液、浸出液或上清液；提取后的載體和殘余的少量溶液稱為殘渣或提取渣。溶劑提取法根據(jù)植物中各種有效成分在溶劑中的溶解作用，選用對有效成分溶解度大，對不需要成分溶解度小的溶劑，而將有效成分從植物組織內提取出來。一、提取法浸提是通過溶劑與原料接觸，互相滲透、溶解以及擴散等一系列復雜過程而完成。由于植物原料的結構非常復雜，提取的物質又是多組分混合物，因此統(tǒng)一的浸提理論難以確定。一般包括：滲透、溶解、分配和擴散等

（1）滲透浸提開始時，滲透隨被浸提植物原料的情況不同而異。如：對干原料，首先要濕潤，一般新鮮的植物材料中水分占80%左右，原料與疏水性的石油醚溶劑接觸時更為困難，為了加快滲透，需添加少量的極性溶劑如乙醇或丙酮等。（2）溶解

溶劑滲入細胞后，可溶解的成分按溶解度大小先后溶解到溶劑中去。對于干原料，以溶解過程為主。在細胞原生質中，溶劑和細胞液是分層的，精油在兩相中都能溶解。若在兩相中溶質濃度不平衡，則在相互接觸時，將在相與相之間進行分配，即為有效成分從細胞液的液相轉入溶劑相中，直到有效成分在細胞原生質液和溶劑兩個液相內達到完全平衡。

（3）分配

K=C1/C2（在一定條件下）K－分配系數(shù)C1－兩相平衡時被浸提組分在浸提液中的濃度C2－兩相平衡時被浸提組分在被浸提混合物中的濃度溶劑的量比細胞原生質中液體的量要大得多，因此浸提比較完全。但是，這種分配現(xiàn)象對某些粉碎的植物原料的浸提可能就不是主要因素，而以溶解占主導作用。（4）擴散：從植物原料中浸提精油時，溶劑經(jīng)滲透浸入含有精油的原料內，在細胞內生成一種溶液。根據(jù)分配原則，精油溶解到與之接觸的溶劑中之后，引起溶劑中溶質濃度的上升；另一方面，溶劑本身將透入含高濃度溶質的細胞原生質溶液，濃度差稱為擴散的動力，擴散作用一直進行到細胞內溶液成分的濃度和細胞外浸提液中成分的濃度達到相等時為止，即擴散濃度差等于零時為止。浸提過程只能更新溶劑，才能重新開始，直到新的濃度平衡時停止。（4）擴散：擴散系數(shù)公式：D=(RT/N)×(1/6πηr)

R－氣體常數(shù)(8.31×107erg/度）

T－熱力學溫度

r－擴散粒子的半徑

N－阿伏加德羅常數(shù)

η—擴散液內部的摩擦因數(shù)，即介質的黏度2.影響提取的因素溶劑浸提成功與否，關鍵在選擇合適的溶劑和提取方法。原料的粉碎度提取時間、溫度等也影響提取效率。樣品粉碎越細，表面積越大，浸出過程快；但同樣由于粉碎度過高，樣品顆粒表面積過大，吸附增強，反而影響過濾速度。一般來說：水提?。嚎捎么址郏?0目）或薄片有機溶劑提?。哼^60目為宜，全草、花類等以20-40目為宜。（1）粉碎度（2）提取溫度：一般來說：冷提雜質少，效率低；熱提雜質多，效率高；但溫度不宜過高，加熱在60℃左右為宜，最高不超過100℃。2.影響提取的因素（3）濃度差：溶劑進入細胞內，成分溶解后因細胞內外濃度差，就向外擴散，內外達到一定濃度時，擴散停止，即到了動態(tài)平衡，成分不再浸出；如果更新溶劑，又開始新的擴散，反復多次直至提取結束。加熱回流提取法最好，最次為浸漬法（4）提取時間：一般來說：提取時間長，浸出量大；但時間過長，無用雜質增多；如用熱水加熱提取：每次0.5h-1h為宜，最多不超過3h；乙醇回流：每次1h-2h為宜；其他試劑可適當增長3.浸出溶劑的選擇植物成分在溶劑中的溶解度直接與溶劑性質有關。溶劑可分為水、親水性有機溶劑和親脂性有機溶劑。一些常見溶劑的親脂性的強弱順序如下：石油醚>苯>氯仿>乙酸乙酯>丙酮>乙醇>甲醇>水一些常見溶劑的親水性的強弱順序如下：石油醚<苯<氯仿<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水3.浸出溶劑的選擇溶劑選擇的三個原則：浸出速度快；浸出物的純度高、雜質少、質量好；成本低3.浸出溶劑的選擇提取活性成分時，可選擇單一溶劑或幾種不同極性的溶劑進行分布提取，將各成分依此提取出來。一般先采用極性低的親脂性溶劑進行提取，往往先將植物加適量水濕潤，晾干后提取。再用能與水相溶的有機溶劑如丙酮、乙醇和甲醇等，最后用水提取。4.提取設備固液萃取主要包括：不溶性固體中所含的溶質在溶劑中溶解的過程；分離殘渣與提取液的過程；在后一個過程中，不溶性固體與提取液往往不能分離完全。4.提取設備操作方式：間歇式、半連接式、連接式固體原料處理方式：固定床、移動床和分散接觸式溶劑和固體原料接觸的方式：多級接觸和微分接觸。選擇設備:固體原料的形狀、顆粒的大小、物理性質、處理難易及所需的費用等。溶劑提取方法浸漬法滲漉法煎煮法回流法連續(xù)回流提取法連續(xù)回流提取法二、萃取法（液-液萃取）1.原理：

兩相溶劑提取稱為萃取法，是利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中的分配系數(shù)的不同進行分離的方法。萃取時，各成分在兩相溶劑中分配系數(shù)相差越大則分離效率越高，可用于從溶液中提取、分離、濃縮有效成分或除去雜質。萃取法的操作溫度低，適于對熱不穩(wěn)定成分的分離；如：水為濃縮液，可用水不相容的溶劑，石油醚、苯、氯仿、乙酸乙酯等KD=分配系數(shù)：在定溫定壓下，如果一個溶質溶解在兩個同時存在的互不相溶的液體里，達到平衡后，設溶質在兩相中濃度的比等于為一常數(shù)在萃余相中的濃度在萃取相中的濃度萃取相一般為水相；萃取相一般為有機相萃取法（液-液萃?。├没旌衔镏懈鞒煞衷趦煞N互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達到分離的方法。萃取時如果各成分的分配系數(shù)相差越大，分離效率越高萃取法（液-液萃?。┨崛∫褐械挠行С煞质怯H脂性的物質，一般多用親脂性有機溶劑，如苯、氯仿或乙醚進行兩相萃??；有效成分是偏于親水性的物質，需用弱親脂性的溶劑，例如乙酸乙酯、丁醇等。提取黃酮類成分多用乙酸乙脂和水的兩相萃取。提取親水性強的皂甙則多選用正丁醇、異戊醇和水作兩相萃取。三、微波提取法微波提?。╩icrowaveassistedextraction)利用微波能進行物質萃取的一種新技術；已經(jīng)涉及到幾大天然化合物（揮發(fā)油、苷類、多糖、萜類、生物堿、甾體）微波提取的原理和特點1.介于300MHz-30GHz（波長在1cm-1m，介于紅外和無線電波之間）之間的電磁波2.提取過程中，微波加熱導致植物細胞內的極性物質吸收微波能，產(chǎn)生熱量，破壞細胞膜和細胞壁。使得胞外溶劑容易進入細胞內，溶解并釋放出細胞內產(chǎn)物。3.當樣品與溶劑混合并被微波輻射時，溶劑短時間內即被加熱至沸點，由于沸騰在密閉容器中發(fā)生，溫度高于溶劑常壓沸點，而且溶劑內外層都達到這一溫度，促使成分很快被提取。4.優(yōu)點：投資少、設備簡單、有效成分得率高、溶劑耗量少，無污染等；5.缺點：設備的一次性投資較大，運行成本高，且難于萃取強極性和大分子量的物質。2.微波提取的裝置和條件裝置包括：微波爐裝置和提取容器（實驗室：商業(yè)化的家用微波爐）提取效益：微波提取頻率、功率和時間實例1微波提取重樓皂苷與水浴加熱回流對比表明：微波并未破壞藥物的結構時間、次數(shù)、含量實例2微波提取紅景天苷與乙醇加熱回流對比微波處理1.5min，水提10min得到；70%乙醇回流提取2h得到物質；提取率一致的條件微波提取的優(yōu)點質量大都相當或優(yōu)于溶劑回流、超臨界二氧化碳提取等；操作方便裝置簡單提取時間短、提取率高溶劑用量少產(chǎn)品純正等四、超聲波提取法超聲波：指頻率高于20KHz，人的聽覺耳閾以外的聲波。

Ch.P（2000）應用超聲波處理的由232品種；Ch.P（1995）應用超聲波處理的有117種；超聲波提?。豪贸暡ň哂械臋C械效應、空化效應及熱效應，通過增大介質分子的運動速度、增大介質的穿透力以提取生物有效分成的方法。1.提取原理（1）機械效應：超聲波在介質中的傳播可以使介質質點在其傳播空間內產(chǎn)生振動，從而強化介質的擴散、傳質。a.輻射壓強對物料有很強的破壞作用，使細胞組織變形、植物蛋白質變性；b.促使產(chǎn)生摩擦力，使生物分子解聚，使細胞壁上的有效成分更快地溶解于溶劑中(2)空化效應通常情況下，介質內部或多或少地溶解了一些微氣泡，這些氣泡在超聲波的作用下產(chǎn)生振動，當聲壓達到一定值時，氣泡由于定向擴散而增大，形成共振腔，然后突然閉合，這就為超聲波的空化效應。(2)空化效應增大的氣泡在閉合時，產(chǎn)生的高壓，形成微激波，可造成植物細胞壁及整個生物體破裂，且在瞬間完成，利于有效成分的溶出。(3)熱效應在介質傳播中，其聲能不斷被介質的質點吸收，介質將所吸收能量的全部或大部分轉變成熱能，從而導致介質本身和藥材組織溫度的升高，增大藥物有效成分的溶解度，加快有效成分的溶解速度。(3)熱效應由于內部溫度的升高是在瞬間完成，可以使被提取成分的結構和生物活性保持不變。2.超聲波的特點不需加熱，適用于對熱敏物質的提取，節(jié)省能源；提高了有效成分的提取率，節(jié)省了原料藥材，利于資源保護；溶劑用量少，節(jié)約溶劑；是一個物理過程，不影響有效成分的生理活性有效成分含量高，利于進一步精制。3.影響超聲波提取的因素時間影響：比常規(guī)提取的時間短，一般在10min-100min以內，較好效果

超聲波頻率：是主要的影響因素；3.影響超聲波提取的因素溫度影響：水一般最佳溫度為60℃，有機溶劑需實驗篩選；

超聲波的凝聚機制：可提高提取率，縮短時間；4.超聲波提取對中藥有效成分性質的影響超聲波提取具有省時、節(jié)能、提取率高的特點；對有機小分子的提取不會破壞分子結構；但對生物大分子，如多肽、蛋白質或酶的提取中，可能會破壞其結構，進而影響其生理活性。五、結晶天然產(chǎn)物化學成分在常溫下，多半是固體物質，都具有結晶化的通性；可以根據(jù)溶解度的不同用結晶達到分離精制成為單體純品。五、結晶純化合物的結晶有一定的熔點和結晶學的特征，有利于鑒定。求得結晶并制備成單體純品，是鑒定天然產(chǎn)物成分、天然產(chǎn)物提取生產(chǎn)的重要步驟。結晶是物質從液態(tài)或氣態(tài)形成晶體的過程，絕大多數(shù)物質的結晶是從液態(tài)通過一定條件形成晶態(tài)。五、結晶晶體具有一定的幾何外形，離子、原子或分子在組成晶體時都形成有規(guī)則的排列；生成結晶的過程叫結晶生長。從比較不純的結晶，再通過結晶作用精制得到較純的結晶，這一過程叫再結晶。1.結晶的方法在工業(yè)上，結晶的方法原理上常分為兩大類第一類

除去一部分溶劑，如蒸發(fā)濃縮使溶液產(chǎn)生過飽和狀態(tài)而析出結晶；第二類不除去溶劑，而用直接加入沉淀劑及降低溫度等方法，使溶液達到飽和狀態(tài)而析出。第二類不除去溶劑，而用直接加入沉淀劑及降低溫度等方法，使溶液達到飽和狀態(tài)而析出。大致可分為：a.鹽析法：用于大分子蛋白質、酶等；b.有機溶劑結晶法：小分子氨基酸等；c.等電點結晶法：多用于兩性物質；d.其他：溫差法，加入金屬離子法等。鹽析法：a.加固體鹽法(以細胞色素C為例）加正丁醇濃縮樹脂洗脫細胞色素C1.加入硫酸銨（0.43g/1g)2.硫酸銨溶解稱量1.加抗壞血栓（5mg/1g)，

36％氨水冷至10℃加少量硫酸銨至溶液微渾濁

塞好塞子放置1-2d(15-25℃)結晶

加硫酸銨（0.02g/ml)結晶完全鹽析法：b.加飽和鹽溶液(牛胰凝乳蛋白酶重結晶為例）溶解在0.01mol/L硫酸中5g粗結晶加入飽和硫酸銨

5ml加100g/LNaCl5mL,5min加完

過濾放置2d(室溫)結晶完全結晶完全放置1h(20℃)溶菌酶溶在0.04mol/L醋酸緩沖液

5mL,pH4.7溶于0.4mol/L硼砂中

pH9粗品7d過濾濾液加入結晶透析液透析透析3-4dc.透析法(以羊胰蛋白酶為例）結晶結晶完全鹽析法：有機溶劑法：a.丙氨酸結晶為例低層析純的丙氨酸