分子生物學(xué)的基本竟能和策略課件

周俊宜

分子生物學(xué)基本技能和策略生化技術(shù)電泳層析離心分光光度基因操作其它基因工程

分切接轉(zhuǎn)篩表

電泳層析離心分光光度基因操作其它

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）

接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞）

篩（選陽(yáng)性克?。┍恚ㄟ_(dá)目的基因）基本模式“縱向”體系“橫向”體系基因工程原理基因重組：不同的DNA分子間發(fā)生共價(jià)連接形成重組DNA分子。重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段1972年,P.Berg:構(gòu)建第一個(gè)DNA重組分子1997年,動(dòng)物克隆:克隆羊多莉1977年，基因工程產(chǎn)品的出現(xiàn)

H.W.Boyer,第一個(gè)基因工程產(chǎn)品(SS)1973年,S.S.Cohen:第一個(gè)基因克隆實(shí)驗(yàn)2001年，人類基因組計(jì)劃pSC101抗四環(huán)素pR6-5抗卡那霉素DNA連接酶重組DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因培養(yǎng)平皿卡那霉素基因四環(huán)素\卡那霉素基因大腸桿菌四環(huán)素平板抗四環(huán)素抗卡那霉素抗四環(huán)素\抗卡那霉素大腸桿菌SS蛋白重組體+SS基因大腸桿菌SS蛋白重組體+SS基因目的基因基因載體

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線1）化學(xué)合成法：較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物測(cè)序引物定點(diǎn)突變核酸雜交探針2）基因文庫(kù)限制性內(nèi)切酶……克隆、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定基因組DNA基因文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝引物引物3’5’5’5’3）PCR技術(shù)基因組PCR技術(shù)的基本過(guò)程模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循環(huán)儀94oC5’94℃55℃72℃2載體DNA的選擇功能：

為目的基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。為目的基因提供在受體細(xì)胞中的復(fù)制能力或整合能力。為目的基因提供在受體細(xì)胞中的擴(kuò)增和表達(dá)能力。理想載體的基本條件：可轉(zhuǎn)移性合適的復(fù)制位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)：廣泛、特異選擇標(biāo)志，便于篩選和鑒定分子較小，可容納較大的外源DNA質(zhì)粒噬菌體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體……種類：宿主細(xì)胞ori抗Amp宿主細(xì)菌含Amp培養(yǎng)基多種酶切口多克隆位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶單一酶切口多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker基因載體

噬菌體載體50kb+LARALARAEcoRⅠEcoRⅠlacZcI限制性內(nèi)切酶酶切切酶切限制性內(nèi)切核酸酶

在特異位點(diǎn)上切割DNA分子分三類，常用為Ⅱ類酶識(shí)別序列呈回文對(duì)稱命名：酶來(lái)源的生物名稱縮寫屬名-種名-株名-發(fā)現(xiàn)次序

5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的識(shí)別序列HaeⅠ的識(shí)別序列5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的識(shí)別序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的識(shí)別序列和酶切切口（平端）磷酸二酯鍵的形成DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶目的基因與載體的連接接

T4-DNA連接酶：T4-噬菌體連接溫度：不高于粘性末端熔點(diǎn)溫度（Tm）≤15℃：15℃/6h；12℃/8h；8℃/12h；連接方式：

相同粘性末端的連接平頭末端的連接不同粘性末端的連接人工粘性末端的連接

粘端連接CCGGCCGGGGCCGGCC

CGGC

CGGCCGGC

CGGC

CCGG

GGCCHapⅡT4-DNA連接酶平端連接

AGCT

TCGAAluⅠDNA連接酶AGCTAGCTTCGATCGA重組體的轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞轉(zhuǎn)JM109感受態(tài)含氨芐平板Am重組質(zhì)粒感受態(tài)原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化）1)受體細(xì)胞的選擇限制缺陷型:避免修飾和降解重組缺陷型：避免重組整合轉(zhuǎn)化親和型：較高的可轉(zhuǎn)化性遺傳互補(bǔ)型：利于篩選感染缺陷型：防止感染2）轉(zhuǎn)化方法CaCl2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化電穿孔PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化人工體外包裝特殊處理受體細(xì)胞細(xì)胞膜特性改變CaCl2處理受體細(xì)菌50-100mmol/LCaCl2

感受態(tài)細(xì)菌重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌基因重組轉(zhuǎn)染體外包裝噬菌體噬菌體體外包裝3）轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)影響因素：

載體：載體性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)、分子大小等受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程含氨芐平板連接目的基因基因載體連接酶轉(zhuǎn)化重組體克隆的篩選與鑒定篩宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化后的克隆群體：1遺傳檢測(cè)法1）抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板2）標(biāo)志補(bǔ)救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段X-galLacZ藍(lán)色化合物X-gal（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶2電泳檢測(cè)法凝膠電泳檢測(cè)加樣孔DNAMarker空質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒酶切重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增片段原位雜交3菌落雜交篩選法4免疫化學(xué)檢測(cè)法放射性抗體檢測(cè)法濾膜（固定抗體）+5DNA序列檢測(cè)ACTGAAGGCT外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)重組子目的基因的mRNA表達(dá)蛋白質(zhì)大腸桿菌（E.coli）受體細(xì)胞表1E.coli表達(dá)體系優(yōu)勢(shì)：

一種成熟的基因克隆表達(dá)的受體細(xì)胞繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制易于進(jìn)行遺傳操作和高效表達(dá)不足之處：1）缺乏適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄后和翻譯后加工機(jī)制。2）缺乏表達(dá)蛋白質(zhì)復(fù)性系統(tǒng)，表達(dá)蛋白無(wú)特異性空間結(jié)構(gòu)。3）表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定，易被細(xì)菌蛋白酶降解。2目的基因在E.coli中的高效表達(dá)三個(gè)因素：

強(qiáng)化蛋白質(zhì)的生物合成抑制蛋白質(zhì)的降解恢復(fù)蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象3目的基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)1）蛋白質(zhì)的PAGE對(duì)照樣品Marker2）表達(dá)蛋白生物學(xué)功能檢測(cè)淀粉酶基因表達(dá)4目的蛋白的分離純化分子篩親和柱離子交換抗原抗體目的蛋白基因載體目的基因

質(zhì)粒噬菌體病毒PCRcDNA人工合成基因文庫(kù)限制性內(nèi)切酶有切口的載體有切口的目的基因DNA連接酶

重組體

轉(zhuǎn)化