基因操作原理05課件

第五章PCR技術(shù)原理PCR，polymerasechainreaction是80年代發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和基因工程及其它與DNA鑒定相關(guān)的其它領(lǐng)域，如疾病檢測(cè)、臨床應(yīng)用、商品檢疫、法醫(yī)鑒定、新藥品的開(kāi)發(fā)等。一、PCRprinciple1．基本要素PCR是指那些模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式在體外選擇性地?cái)U(kuò)增DNA某個(gè)特殊區(qū)域的技術(shù)·template：ssDNAordsDNA·primers：oligo-nucleotides等·substrates:dNTP·DNApolymerase:TaqpolyDNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'templateprimerDNApolymeraseDNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'

-DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'

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引物設(shè)計(jì)原理①長(zhǎng)度至少16bp,通常20-30bp②Tm=81.5+16.61og[J+]+0.41(G+C)%-(675/N)N:鏈長(zhǎng)J：?jiǎn)蝺r(jià)離子濃度若N=20G+C%=55%[J+]=60mmol/L則Tm=81.5-20.3+22.6-33.75=50.05簡(jiǎn)單計(jì)算Tm=(G+C)×4+(A+T)×2對(duì)于較短引物Operon公司③避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成二聚體二級(jí)結(jié)構(gòu)④G/C和A/T分布盡量均勻,一般G+C%45-55%oligodT/oligodC除外，

⑤其它，如5’末端，限制酶位點(diǎn)的長(zhǎng)度⑥隨機(jī)引物6nt10-12nt4.模板templategorng1021051g人類單拷貝基因組DNA3×105targets10ngyeastDNA3×1051ngE.coliDNA3×1051ng1kbDNA9×1061%M13plaque1065.聚合酶DNApolymerase

1-2U早期使用klenow(1)TaqDNApolymerase,75℃,94kDaThermusaquticus嗜熱水生菌，水生棲熱菌具有5’--3’合成和5’3’外切,無(wú)35’外切Taqhalf-time>2hr92.5℃40min95℃5min97.5℃相似酶,Tflpolymerase,82kDa

Thermusflavus使用MgSO4·sequencinggrade74℃低5’3’外切活性80kDa(2)TthDNApolymeraseThermusthermophilusHB8,94kDa,Mg2+:5’3’合成DNAMn2+:以RNA為模板合成cDNA可解決RNA反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)·反轉(zhuǎn)錄:primerextension,cDNA合成(3)具3’--5’外切活性的高溫DNApolymeraseA.VentDNApoly(NewEnglandBlabs)

Thermococcuslitoralis,85kDaHalf-life:1.8hrat100℃(使用MgSO4)而Taq5minB.TliDNApoly(Promega)85kDa來(lái)源同VentC．PwoPyrococcuswoesei(BMRoche)90kDaHalf-life>2hrat100℃<5minforTaqD.PfuPyrococcusfuriosus激烈熱球菌（stratagene）E.商用混合酶pfuIdealforhigh-fidelityamplificationLowesterrorrateofanythermostableDNApolymerasestudiedOneofthemostthermostableDNApolymerasesknownLackofextendaseactivitymeansnounwanted3’overhangsOptimalforblunt-endPCRcloningOptimumtemperaturenear75°C95%activeafter1-hourincubationat98°CNativeandrecombinantversionsavailable三、PCR反應(yīng)程序1.常用程序94-96℃預(yù)加熱10’’-幾分鐘/加酶94℃30”55℃30”72℃1’72℃3-7min4℃2．復(fù)性（退火溫度）Tm-5℃特異性高，需高溫若高Tm，則采用2步法55℃-72℃有時(shí)用37℃(隨機(jī)引物)3．時(shí)間變性30”若G+C高可長(zhǎng)，若為Cell可長(zhǎng)復(fù)性30”(20”-40”)延伸1min>>1kb55℃24nt/秒37℃1.5nt/秒72℃500bp20’’,1.2kb40’’存在二級(jí)結(jié)構(gòu)也應(yīng)延長(zhǎng)時(shí)間特殊:10循環(huán)后，每次延伸增加，10”,30”,or1’4．循環(huán)次數(shù)25～35tergest(起始模板)所須循環(huán)數(shù)3×10525～30(1ug哺乳動(dòng)物DNA)1.5×10430～351×10335～405040～45Nf=N0(1+Y)nN0起始拷貝數(shù)，Nf最終拷貝數(shù)，Y延伸效率，n循環(huán)數(shù)ifNf=1012,

Y=70%,N0=3×105,thenn=28.6平臺(tái)效應(yīng)plateaueffect在PCR反應(yīng)后期,產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長(zhǎng)(一般已積累到0.3～1pmol產(chǎn)物)原因:底物濃度降低，dNTPorPrimersdNTPorenzyme的穩(wěn)定性末端產(chǎn)物抑制(pyrophosphate焦磷酸,dsDNA)非特異性競(jìng)爭(zhēng)(非特異性產(chǎn)物orprimer-dimer)特異性產(chǎn)自身復(fù)性(>10-8M)高濃度產(chǎn)物下,變性不徹底.避免出現(xiàn)背景5．反應(yīng)液的配制(1)常規(guī)最后加酶,及礦物油(2)具3’-5’活性酶A:template,primer,dNTPH2OB:bufenzymeH2O(3)熱起始下層:dNTPbufprimer中間:蠟珠(AmpliWaxPCRQam100)上層:template(Taq)·先加下層液,再一粒蠟株,70℃10min5℃5min·迅速加30l上層混合物PerkinElmer4800MJResearch四、PCR介導(dǎo)的克隆(一)添加限制性酶切位點(diǎn)1.引物的設(shè)計(jì)(引入酶切位點(diǎn)）

切點(diǎn)的類型優(yōu)先8base序列,如AscINotIPacI,PmeI,SfiI,SrfI若內(nèi)部序列為已知,則可根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)計(jì)

切點(diǎn)的位置參見(jiàn)限制性內(nèi)切酶部分如EcoRI,5’端有一個(gè)C，在2hr內(nèi)可切割90%HindIII5’端有3個(gè)C在2hr內(nèi)可切割10%20hr內(nèi)可切割75%2．綜合處理(當(dāng)酶切位點(diǎn)在最末端時(shí))Kinase處理，在5’端加一個(gè)磷酸Klenow補(bǔ)平Ligase連接成多聚體酶切，回收目標(biāo)DNA片段3.NestPCR1st2nd（二）A/T克隆法1.PCR產(chǎn)物：Taqpoly產(chǎn)物的3’末端一般要在3’末端加一個(gè)核苷酸,通常為A2.載體pGEM-T,pGEM-TEasy(promega)pCR-3,pCR-II,pCR-3-Uni(半磷酸化)(Invitrogen)核心線性DNA·末端轉(zhuǎn)移酶加ddTMP·產(chǎn)生單個(gè)T的限制性內(nèi)切酶如MboII,XcmI,HphI,HphI,GGTGA(8/7)MobII,GAAGA(8/7)·TaqDNApoly+高濃度dTTP（三）平端克隆法用于克隆具3’→5’外切活性的DNApoly擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物·pCRScript(stratagene)類似pBluescriptMSC:NofISrfI,BamHI,SmaI,PstI,EcoRI,EcoRVH3SrfI:GCCC↓GGGCSmaI,CCC↓GGGC·pCRScriptSrfI（四）不需要連接反應(yīng)的克隆方法1．UDG克隆法UDG酶是參與TTP生物合成的一種酶，水解脫氧核糖與尿嘧啶之間的N-糖苷鍵,產(chǎn)生脫堿基的dU,從而破壞DNA的堿基配對(duì)Uracil-DNAGlycosylase2．外切法（五）反向PCR(inversePCR)“正向”“反向”（六）長(zhǎng)片段的PCR克隆許多公司開(kāi)發(fā)出一些用于擴(kuò)增長(zhǎng)片段的反應(yīng)體系多用混合酶(如Pwo,Pfu)來(lái)擴(kuò)增TaqPwoLongsys0.9kb1.1kb2.94.86.3科學(xué)出版社C.W.迪芬巴赫/G.S德維克斯勒，1998C．W．Dieflenbach/G.S.Dueksler五、PCR介導(dǎo)的誘變(一)PCR隨機(jī)突變每循環(huán)Taq錯(cuò)配率在0.1～2×10-4之間。20-25cycles后，每個(gè)核苷酸產(chǎn)生的累積錯(cuò)誤率達(dá)10-3,但對(duì)于構(gòu)建一個(gè)具有不同序列的變異庫(kù)仍然不夠，特別是<1kb的片段。原因：在普通條件下，具較大定向錯(cuò)配即AT對(duì)變GC對(duì)。設(shè)計(jì)出一種致突變PCR法，使錯(cuò)誤率達(dá)7×10-3，且無(wú)傾向性。①M(fèi)g2+→7mM②Mn2+→0.5mM③提高dCTT/dTTT到1M，促進(jìn)錯(cuò)誤摻入④提高Taq酶量，促進(jìn)延伸鏈在堿基錯(cuò)配位置繼續(xù)延伸DNAshuffling,DNA改組,無(wú)引物PCRDNaseI處理DNA片段，分子進(jìn)化(二)PCR定點(diǎn)誘變1．同源重組法在一般宿主內(nèi)發(fā)生同源重組,但需高轉(zhuǎn)化效率1x109/ug2．DpnI法DpnI只切割甲基化的DNA,在PCR擴(kuò)增后，可切除模板DNA從而使得用突變引物擴(kuò)增出來(lái)DNA保存下來(lái)GeneinplasmidwithmutationtargetsiteDenatureplasmidandannealingprimerscontainingdesiredmutationMutagenicprimersTemperaturecycletoextendandincorporatemutationprimersresultinginnickedcirclarstrandstransformDigestparentalDNAtemplateAftertransformation,XL1-BlueE.colicellrepairsnicksinplasmidTransformtheresultingannealeddouble-strandednickedDNAmoleculesMutated