食品中合成著色劑的測定方法︱食品中合成著色劑的檢測分析方法

食品中合成著色劑的測定方法︱食品中合成著色劑的檢測分析方法1、主題內(nèi)容與適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中合成著色劑的測定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中合成著色劑的測定。

第一篇高效液相色譜法(第一法)

2、食品中合成著色劑的測定原理

食品中人工合成著色劑用聚酰胺吸附法或液－液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色譜儀，經(jīng)反相色譜分離，根據(jù)保留時間定性和與峰面積比較進(jìn)行定量。最小檢出量，新紅5ng、檸檬黃4ng、莧菜紅6ng、胭脂紅8ng、日落黃7ng、赤蘚紅18ng、亮藍(lán)26ng，當(dāng)進(jìn)樣量相當(dāng)0.025g時最低檢出濃度分別為0.2mg//k；0.16mg/kg；0.24mg/kg；0.32mg/kg；0.28mg/k；0.72mg/k；1.04mg/k。

3、食品中合成著色劑的測定試劑

3.1正己烷。

3.2鹽酸。

3.3乙酸。

3.4甲醇：經(jīng)濾膜(0.5?m)過濾。

3.5聚酰胺粉(尼龍6)：過200目篩。

3.6乙酸銨溶液(0.02mol/L)：稱取1.54g乙酸銨，加水至1000mL，溶解，經(jīng)濾膜(0.45?m)過濾。

3.7氨水：量取氨水2mL，加水至100mL，混勻。

3.8氨水－乙酸銨溶液(0.02mol/L)：量取氨水0.5mL，加乙酸銨溶液(0.02mol/L)至1000mL，混習(xí)。

3.9甲醇－甲酸(6＋4)溶液：量取甲醇60mL，甲酸40mL，混勻。

3.10檸檬酸溶液：稱取20g檸檬酸(C6H8O7·H2O)，加水至100mL，溶解混勻。

3.11無水乙醇－氨水－水(7＋2＋1)溶液：量取無水乙醇70mL、氨水20mL、水10mL，混勻。

3.12三正辛胺正丁醇溶液(5%)：量取三正辛胺5mL，加正丁醇至100mL，混勻。

3.13飽和硫酸鈉溶液。

3.14硫酸鈉溶液(2g/L)。

3.15pH6的水：水加檸檬酸溶液調(diào)pH值到6。

3.16合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)各0.100g，置100mL容量瓶中，加pH6水到刻度。配成水溶液(1.00mg/mL)。

3．17合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)使用液：臨用時上述溶液（或?qū)?．16）加水稀釋20倍，經(jīng)濾膜（0．45?m）過濾。配成每毫升相當(dāng)50．0?g的合成著色劑。

4、食品中合成著色劑的測定儀器

高效液相色譜儀，帶紫外檢測器，254nm波長。

5、食品中合成著色劑的測定分析步驟

5.1樣品處理

5.1.1桔子汁、果味水、果于露汽水等：稱取20．0～40．0g，放入100mL燒杯中。含二氧化碳樣品加熱驅(qū)除二氧化碳。

5.1.2配制酒類：稱取20．0～40．0g，放100mL燒杯中，加小碎瓷片數(shù)片，加熱驅(qū)除乙醇。

5.1.3硬糖、蜜餞類、淀粉軟糖等：稱取：5．00～10．00小粉碎樣品，放入100mL小燒杯中，加水30mL，溫?zé)崛芙?，若樣品溶液pH值較高，用檸檬酸溶液調(diào)pH值到6左右。

5.1.4巧克力豆及著色糖衣制品：稱取5．00～10．00g，放入100mL小燒杯中，用水反復(fù)洗滌色素，到巧克力豆無色素為止，合并色素漂洗液為樣品溶液。

5.2色素提取

5.2.1聚酞胺吸附法：樣品溶液加檸檬酸溶液調(diào)pH值到6，加熱至60℃，將1g聚酞胺粉加少許水調(diào)成粥狀，倒入樣品溶液中，攪拌片刻，以G3垂融漏斗抽濾，用60℃pH=4的水洗滌3～5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗滌3～5次（含赤薛紅的樣品用5．2．2法處理），再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5mL收集解吸液，加乙酸中和，蒸發(fā)至近干，加水溶解，定容至5mL經(jīng)濾膜（0．45?m）過濾，取10?L進(jìn)高效液相色譜儀。5.2.2液-液分配法（適用于含赤躥紅的樣品）：將制備好的樣品溶液放入分液漏斗中，加2mL鹽酸、三正辛胺正丁醇溶液（5％）10～20mL，振搖提取，分取有機(jī)相，重復(fù)提取，至到有機(jī)相無色，合并有機(jī)相，用飽和硫酸鈉溶液洗2次，每次10mL，分取有機(jī)相，放蒸發(fā)皿中，水浴加熱濃縮至10mL，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加60mL正己烷，混勻，加氨水提取2～3次，每次5mL合并氨水溶液層（含水溶性酸性色素），用正己烷洗2次，氨水層加乙酸調(diào)成中性，水浴加熱蒸發(fā)至近干，加水定容至5mL經(jīng)濾膜（0．45?m）過濾，取10?L進(jìn)高效液相色譜儀。

5.3高效液相色譜參考條件

5.3.1柱：YWG-Cl810?m不銹鋼柱4．6mm（id）×250mm。

5.3.2流動相：甲醇-0．02mol／L乙酸鉸溶液（pH=4）。

5.3.3梯度洗脫：甲醇：20％～35％，3％／min；35％～98％，9％／min；98％繼續(xù)6min。

5.3.4流速：lmL／min。

5.3.5紫外檢測器，254nm波長。

5.4測定

取相同體積樣液和合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)使用液分別注入高效液相色譜儀，根據(jù)保留時間定性，外標(biāo)峰面積法定量。

5.5計算

式中：X1——樣品中著色劑的含量，g/kg；

m1——樣液中著色劑的質(zhì)量，?g；

V2——進(jìn)樣體積，mL；

V1——樣品稀釋總體積，mL；

m2——樣品質(zhì)量，g。

結(jié)果的表述：報告算術(shù)平均值的二位有效數(shù)。

5.6允許差

相對相差≤10%。

5.7其他

第二篇薄層色譜法(第二法)

6、食品中合成著色劑的測定原理

水溶性酸性合成著色劑在酸性條件下被聚酰胺吸附，而在堿性條件下解吸附，再用紙色譜法或薄層色譜法進(jìn)行分離后，與標(biāo)準(zhǔn)比較定性、定量。最低檢出量為50?g，點樣量為1g，樣品最低檢出濃度約為50mg/kg。

7、食品中合成著色劑的測定試劑

7.1石油醚：沸程60～90℃。

7.2甲醇。

7.3聚酰胺粉(尼龍6)：200目。

7.4硅膠G。

7.5硫酸：(1＋10)。

7.6甲醇－甲酸溶液：(6＋4)。

7.7氫氧化鈉溶液(50g/L)。

7.8海沙：先用鹽酸(1＋10)煮沸15min，用水洗至中性，再用氫氧化鈉溶液(50g/L)煮沸15min，用水洗至中性，再于105℃干燥，貯于具玻璃塞的瓶中，備用。

7.9乙醇(50%)。

7.10乙醇－氨溶液：取1mL氨水，加乙醇(70%)至100mL。

7.11pH6的水：用檸檬酸溶液(20%)調(diào)節(jié)至pH6。

7.12鹽酸(1＋10)。

7.13檸檬酸溶液(200g/L)。

7.14鎢酸鈉溶液(100g/L)。

7.15碎瓷片：處理方法同7.8。

7.16展開劑

7.16.1正丁醇－無水乙醇－氨水(1%)(6＋2＋3)：供紙色譜用。

7.16.2正丁醇－吡啶－氨水(1%)(6＋3＋4)：供紙色譜用。

7.16.3甲乙酮－丙酮－水(7＋3＋3)：供紙色譜用。

7.16.4甲醇－乙二胺－氨水(10＋3＋2)：供薄層色譜用。

7.16.5甲醇－氨水－乙醇(5＋1＋10)：供薄層色譜用。

7.16.6檸檬酸鈉溶液(25g/L)－氨水－乙醇(8＋1＋2)：供薄層色譜用。

7.17合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液：按3.16方法，分別配制著色劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為每毫升相當(dāng)于1.0mg。

7.18著色劑標(biāo)準(zhǔn)使用液：臨用時吸取色素標(biāo)準(zhǔn)溶液各5.0mL，分別置于50mL容量瓶中，加pH6的水稀釋至刻度。此溶液每毫升相當(dāng)于0.10mg著色劑。

8、食品中合成著色劑的測定儀器

8.1可見分光光度計。

8.2微量注射器或血色素吸管。

8.3展開槽，25cm×6cm×4cm。

8.4層析缸。

8.5濾紙：中速濾紙，紙色譜用。

8.6薄層板：5cm×20cm。

8.7電吹風(fēng)機(jī)。

8.8水泵。

9、食品中合成著色劑的測定分析步驟

9.1樣品處理

9.1.1果味水、果子露、汽水：稱取50.0g樣品于100mL燒杯中。汽水需加熱驅(qū)除二氧化碳。

9.1.2配制酒：稱取100.0g樣品于100mL燒杯中，加碎瓷片數(shù)塊，加熱驅(qū)除乙醇。

9.1.3硬糖、蜜餞類、淀粉軟糖：稱取5.00或10.0g粉碎的樣品，加30mL水，溫?zé)崛芙猓魳右簆H值較高，用檸檬酸溶液(200g/L)調(diào)至pH4左右。

奶糖：稱取10.0g粉碎均勻的樣品，加30mL乙醇－氨溶液溶解，置水浴上濃縮至約20mL，立即用硫酸溶液(1＋10)調(diào)至微酸性再加1.0mL硫酸(1＋10)，加1mL鎢酸鈉溶液(100g/L)，使蛋白質(zhì)沉淀、過濾，用少量水洗滌，收集濾液。

蛋糕類：稱取10.0g粉碎均勻的樣品，加海沙少許，混勻，用熱風(fēng)吹干用品(用手摸已干燥即可以)，加入30mL石油醚攪拌。放置片刻，傾出石油醚，如此重復(fù)處理三次，以除去脂肪，吹干后研細(xì)，全部倒入G3垂融漏斗或普通漏斗中，用乙醇－氨溶液提取色素，直至著色劑全部提完，以下按自“置水浴上濃縮至約20mL”起依法操作。

9.2吸附分離

將處理后所得的溶液加熱至70℃，加入0.5～1.0g聚酰胺粉充分?jǐn)嚢?，用檸檬酸溶?200g/L)調(diào)pH至4，使著色劑完全被吸附，如溶液還有顏色，可以再加一些聚酰胺粉。將吸附著色劑的聚酰胺全部轉(zhuǎn)入G3垂融漏斗中過濾(如用G3垂融漏斗過濾可以用水泵慢慢地抽濾)。用pH4的70℃水反復(fù)洗滌，每次20mL，邊洗邊攪拌。若含有天然著色劑，再用甲醇－甲酸溶液洗滌1～3次，每次20mL，至洗液無色為止。再用70℃水多次洗滌至流出的溶液為中性。洗滌過程中必須充分?jǐn)嚢?。然后用乙醇－氨溶液分次解吸全部著色劑，收集全部解吸液，于水浴上?qū)氨。如果為單色，則用水準(zhǔn)確稀釋至50mL，用分光光度法進(jìn)行測定。如果為多種著色劑混合液，則進(jìn)行紙色譜或薄層色譜法分離后測定，即將上述溶液置水浴上濃縮至2mL后移入5mL容量瓶中，用乙醇(50%)洗滌容器，洗液并入容量瓶中并稀釋至刻度。

9.3定性

9.3.1紙色譜

取色譜用紙，在距底邊2cm的起始線上分別點3～10?L樣品溶液、1～2?L著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，掛于分別盛有7.16.1、7.16.2的展開劑的層析缸中，用上行法展開，待溶劑前沿展至15cm處，將濾紙取出于空氣中晾干，與標(biāo)準(zhǔn)斑比較定性。

也可取0.5mL樣液，在起始線上從左到右點成條狀，紙的左邊點著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，依法展開，晾干后先定性后再供定量用。靛藍(lán)在堿性條件下易褪色，可用7.16.3展開劑。

9.3.2薄層色譜

薄層板的制備

稱取1.6g聚酰胺粉、0.4g可溶性淀粉及2g硅膠G，置于合適的研缽中，加15mL水研勻后，立即置涂布器中鋪成厚度為0.3mm的板。在室溫晾干后，于80℃干燥1h，置干燥器中備用。

點樣

離板底邊2cm處將0.5mL樣液從左到右點成與底邊平行的條狀，板的左邊點2?L色素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

展開

莧菜紅與胭脂紅用7.16.4展開劑，靛藍(lán)與亮藍(lán)用7.16.5展開劑，檸檬黃與其他著色劑用7.16.6展開劑。取適量展開劑倒入展開槽中，將薄層板放入展開，待著色劑明顯分開后取出，晾干，與標(biāo)準(zhǔn)斑比較，如Rf值相同即為同一色素。

9.4定量

9.4.1樣品測定

將紙色譜的條狀色斑剪下，用少量熱水洗滌數(shù)次，洗液移入10mL比色管中，并加水稀釋至刻度，作比色測定用。

將薄層色譜的條狀色斑包括有擴(kuò)散的部分，分別用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇－氨溶液解吸著色劑，少量反復(fù)多次至解吸液于蒸發(fā)皿中，于水浴上揮去氨，移入10mL比色管中，加水至刻度，作比色用。

9.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別吸取0、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0mL胭脂紅、莧菜紅、檸檬黃、日落黃色素標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，或0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL亮藍(lán)、靛藍(lán)色素標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，分別置于10mL比色管中，各加水稀釋至刻度。

上述樣品與標(biāo)準(zhǔn)管分別用1cm比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點，于一定波長下(胭脂紅510nm，莧菜紅520nm，檸檬黃430nm，日落黃482nm，亮藍(lán)627nm，靛藍(lán)620nm)，測定吸光度，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線比較或與標(biāo)準(zhǔn)色列目測比較。

9.5計算

式中：X2——樣品中著色劑的含量，g/kg；

m3——測定用樣液中色素的質(zhì)量，mg；

m4——樣品質(zhì)量(體積)，g(mL)；

V3——樣品解吸后總體積，mL；

V4——樣液點板(紙)體積，mL。

結(jié)果的表述：報告算術(shù)平均值的二位有效數(shù)。

附加說明：

GB/T5009.35-1996（國家標(biāo)準(zhǔn)）本標(biāo)