免疫分析法課件

第三章免疫分析法一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用五、免疫擴(kuò)散法主要內(nèi)容一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用五、免疫擴(kuò)散法主要內(nèi)容(1)在實(shí)驗(yàn)藥物動(dòng)力學(xué)和臨床藥物學(xué)中，測(cè)定生物利用度和藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)等生物藥劑學(xué)中的重要數(shù)據(jù)，以便了解藥物在體內(nèi)的吸收、分解、代謝和排泄情況；(2)在藥物的臨床檢測(cè)中，對(duì)治療指數(shù)小、超過(guò)安全劑量易發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)或最佳治療濃度和毒性反應(yīng)濃度有交叉的藥物血液濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)；(3)在藥物生產(chǎn)中，從發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中快速測(cè)定有效組分的含量，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的在線(xiàn)監(jiān)測(cè)；(4)對(duì)藥品中是否存在特定的微量有害雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在藥物分析中，免疫分析法的應(yīng)用主要集中在以下幾方面：免疫分析：

利用抗原與抗體的特異性結(jié)合作用，來(lái)選擇性識(shí)別和測(cè)定，可以作為抗體或抗原的待測(cè)物.免疫分析方法非標(biāo)記免疫分析（抗原抗體結(jié)合理化性質(zhì)發(fā)生變化）標(biāo)記免疫分析標(biāo)記物有無(wú)非放射免疫分析放射免疫分析（放射污染）酶聯(lián)免疫分析熒光免疫分析電化學(xué)免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析免疫分析免疫分析檢測(cè)的發(fā)展放射免疫檢測(cè)（興起于20世紀(jì)70年代)酶聯(lián)免疫檢測(cè)（興起于20世紀(jì)80年代，各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）；以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測(cè)技術(shù)（20世紀(jì)90年代開(kāi)始推廣使用，產(chǎn)品步入成長(zhǎng)期）三個(gè)階段。特異性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專(zhuān)一性分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性可逆性可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體，解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。影響因素：

抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力－－親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響－pH、離子強(qiáng)度比例性和反應(yīng)階段性比例性：抗原與抗體發(fā)生可見(jiàn)反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系前帶(prezone)：抗體過(guò)量后帶(postzone)：抗原過(guò)量等價(jià)帶(equivalencezone)：抗原抗體比例合適

抗原（antigen,Ag)：是一類(lèi)能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體和致敏淋巴細(xì)胞)在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)抗原的兩種特性：免疫原性和抗原特異性免疫原性（immunogenicity)，能刺激機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞的能力。抗原特異性能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的能力。

凡具有免疫原性和抗原性的物質(zhì)稱(chēng)為完全抗原只有抗原特異性而不具有免疫原性的物質(zhì)稱(chēng)為半抗原

半抗原+蛋白質(zhì)——完全抗原賦予半抗原以免疫原性的蛋白質(zhì)稱(chēng)為載體。

定義1.抗原的免疫原性抗原物質(zhì)必須具備的條件：一、異物性二、一定的理化性狀三、完整性四、宿主的遺傳性一、異物性

異物是指化學(xué)結(jié)構(gòu)與宿主的自身成分相異或機(jī)體的免疫細(xì)胞從未與它接觸過(guò)的物質(zhì)。異物性的物質(zhì)包括以下幾類(lèi)：

1、異種物質(zhì)如：馬血清蛋白、各種微生物及其代謝產(chǎn)物對(duì)人體而言都是異種物質(zhì)，具有強(qiáng)的免疫原性。

2、同種異體物質(zhì)如：ABO血型抗原、人類(lèi)主要組織相容性抗原。

3、自身抗原物質(zhì)如：自身組織成分結(jié)構(gòu)改變、隱蔽性自身成分暴露構(gòu)成自身抗原。三、完整性

具有一定理化性狀的物質(zhì)須經(jīng)非消化道途徑進(jìn)入機(jī)體（包括注射、吸入、混入傷口等），并接觸淋巴細(xì)胞，才能成為良好抗原。如果是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破壞了其結(jié)構(gòu)，就喪失了免疫原性。自然界中天然的抗原物質(zhì)有：蛋白質(zhì)、多糖、核蛋白四、宿主遺傳性

抗原的免疫原性也與機(jī)體的應(yīng)答能力有關(guān)，同種動(dòng)物不同個(gè)體對(duì)同一種抗原的免疫應(yīng)答存在明顯的差異，這種差異受遺傳因素控制，控制免疫應(yīng)答的基因稱(chēng)為免疫應(yīng)答基因（immuneresponse,Ir)。2.抗原特異性抗原決定簇（基）載體決定簇和半抗原決定簇共同抗原和交叉反應(yīng)4、大小抗原決定簇的大小與相應(yīng)抗體的抗原結(jié)合部位相當(dāng)。一個(gè)蛋白質(zhì)抗原決定簇含5-7個(gè)氨基酸殘基一個(gè)多糖抗原決定簇含5-7個(gè)單糖一個(gè)核酸半抗原決定簇含6-8個(gè)核苷酸5、抗原結(jié)合價(jià)（antigenicvalence)是指能和抗體分子結(jié)合的抗原決定簇的總數(shù)。半抗原為一價(jià)天然抗原的分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子表面有多個(gè)決定簇為多價(jià)構(gòu)象決定簇：序列上不相連而依賴(lài)于蛋白質(zhì)或多糖的空間構(gòu)象形成的決定簇，多暴露于分子表面。順序決定簇：一段相連的氨基酸序列所形成的決定簇，多位于抗原分子內(nèi)部。功能性AD：分子表面，易被識(shí)別。隱蔽性AD：分子內(nèi)部。B細(xì)胞決定簇：分子表面。T細(xì)胞決定簇：分子內(nèi)部。二、AD的分類(lèi)三、共同抗原和交叉反應(yīng)兩種來(lái)源不同的抗原，除各有其主要的特異性抗原決定簇外，相互之間也存在部分相同的抗原決定簇，這種共有的抗原決定簇稱(chēng)為共同抗原。親緣關(guān)系很近的生物之間存在的共同抗原稱(chēng)為類(lèi)屬抗原。無(wú)種屬關(guān)系的生物之間存在的共同抗原稱(chēng)為異嗜性抗原。一種共同抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體，可與其他含有共同抗原的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，稱(chēng)為交叉反應(yīng)。3、藥物分析中，為了得到高效價(jià)的抗血清，通常會(huì)與蛋白質(zhì)載體合成人工抗原進(jìn)行試驗(yàn)。常用載體：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破傷風(fēng)類(lèi)毒素（TT）、鑰孔蛋白（KLH）等。（1）半抗原和載體結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)多肽類(lèi)激素：活化蛋白質(zhì)或多肽的游離羧基形成肽鍵；與蛋白質(zhì)或多肽的游離氨基縮合形成肽鍵甾體：甾體激素的羥基和酮基不能直接和載體蛋白形成有效的共價(jià)鍵，需要制備甾體的衍生物，通過(guò)含游離羧基的甾體衍生物與載體蛋白相連抗生素：?-內(nèi)酰胺環(huán)在偏堿性條件下可以與蛋白質(zhì)的自由氨基以酰胺鍵的形式共價(jià)結(jié)合；氨基糖苷類(lèi)抗生素用碳化二亞胺為連接劑實(shí)現(xiàn)藥物和載體蛋白的連接載體選擇原則：應(yīng)考慮載體對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的影響：選擇的載體應(yīng)和檢測(cè)體系不發(fā)生交叉反應(yīng)；用于包被合成抗原的載體和用于免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體的合成抗原的載體蛋白不同。免疫過(guò)程中考慮載體效應(yīng)的影響：抗體的特異性依賴(lài)于半抗原分子結(jié)構(gòu)中的免疫決定區(qū)，但整個(gè)載體蛋白大分子對(duì)于抗體反應(yīng)的性質(zhì)和量也有影響；應(yīng)使用相同載體的合成抗原制備半抗原抗體。（3）合成抗原的測(cè)定定性測(cè)定方法：

光譜分析：半抗原和載體蛋白的結(jié)合導(dǎo)致蛋白構(gòu)象的改變，改變程度和半抗原的結(jié)合量有關(guān)，半抗原結(jié)合量越大，構(gòu)象改變程度越大。

熱力學(xué)分析：半抗原和載體蛋白結(jié)合后熱力學(xué)特征會(huì)有變化，差異可通過(guò)差示掃描量熱法（DCS）等方法測(cè)定。定量測(cè)定方法

相對(duì)含量測(cè)定法：通過(guò)ELISA法比較半抗原與載體蛋白的相對(duì)結(jié)合量。絕對(duì)含量測(cè)定法：半抗原具有與載體蛋白完全不同的廣譜吸收特征，且半抗原在此特定波長(zhǎng)下具有較強(qiáng)的吸收；或能利用特定的化學(xué)反應(yīng)定量測(cè)定半抗原的量，且不與載體蛋白發(fā)生反應(yīng)。一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用五、免疫擴(kuò)散法主要內(nèi)容免疫分析實(shí)際上是一種特殊的試劑分析，特點(diǎn)是抗體/抗原成為分析試劑。

1、抗體的結(jié)構(gòu)與功能

抗體泛指機(jī)體經(jīng)抗原刺激由免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生的一組免疫球蛋白，通常由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成常用的是IgG分子，其在血清免疫球蛋白中的含量約70%1.抗體（antibody,Ab）功能性概念

是由抗原刺激而產(chǎn)生并能與刺激其產(chǎn)生的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的、具有免疫功能的球蛋白。抗體主要存在血清中，也存在于呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液以及乳汁等其它體液中。2.免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）結(jié)構(gòu)性概念

具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體分子相似的球蛋白。所有抗體都是免疫球蛋白，但是并非所有免疫球蛋白都是抗體。免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)

IgG分子基本結(jié)構(gòu)是由四個(gè)肽鏈組成的，二條較小的輕鏈和二條較大的重鏈，輕鏈與重鏈?zhǔn)怯啥蜴I連接形成，分為氨基端（N端），羧基端（C端）。

一、多克隆抗體（polyclonalantibody）1.定義：抗原分子通常具有多個(gè)抗原決定簇，動(dòng)物免疫后可刺激多種具有相應(yīng)抗原受體的B細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，因而可產(chǎn)生多種針對(duì)不同抗原決定簇的抗體。這些由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體稱(chēng)為多克隆抗體（polycolonalantibody,PcAb）。2.實(shí)際意義（1）預(yù)防、治療感染性疾?。ㄌ禺愋圆?，可發(fā)生超敏反應(yīng)）（2）臨床診斷二、單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）

1.定義：由單一克隆B細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只識(shí)別抗原分子某一特定抗原決定簇的、具有高度特異性的抗體。每種單克隆抗體其類(lèi)、亞類(lèi)、型及親和力完全相同，具有高度均一性。

2.特點(diǎn)具有高度均一性。

3.雜交瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞—無(wú)限增殖；免疫B細(xì)胞—合成、分泌特異性抗體。

4.雜交瘤技術(shù)

HAT培養(yǎng)基：次黃嘌(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。三、基因工程抗體

基因工程抗體是通過(guò)PCR技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當(dāng)載體重組后引入不同表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體，被廣泛應(yīng)用于疾病的臨床診斷、預(yù)防和治療及基礎(chǔ)理論研究等領(lǐng)域。人-鼠嵌合抗體（chimericantibody）；人改型抗體（reshapedhumanizedantibody）；小分子抗體；雙特異性抗體（bispecificantibody）等。μ、γ、α、δ、ε

IgMIgGIgAIgDIgE

2．抗體作為分析試劑的評(píng)價(jià)

抗體的特異性是無(wú)與倫比的，不需或只需要簡(jiǎn)單的預(yù)處理。有較高的穩(wěn)定性。這兩點(diǎn)奠定了分析免疫高度靈敏和高度專(zhuān)一的基礎(chǔ)。此外，抗體還有一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)：每個(gè)抗體分子有兩個(gè)抗原的結(jié)合點(diǎn)，即多價(jià)性。然而抗體缺乏高靈敏試劑應(yīng)具備的分析信號(hào)反差。

3、抗體的制備（1）常規(guī)抗血清（多克隆抗體）：指人工被動(dòng)免疫后制成的多克隆抗體，是免疫分析中的重要工具。免疫原的制備、動(dòng)物免疫、放血、抗血清分離及抗血清的分析鑒定。免疫原的制備免疫原由質(zhì)量好的抗原與佐劑制成。通常有免疫原水劑、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑。水劑由無(wú)菌生理鹽水將抗原制成一定濃度的免疫原。弗氏佐劑是由一定量的羊毛脂和石蠟油，以及一定濃度的分支桿菌混合而成，經(jīng)研磨達(dá)到油包水的程度。不完全福氏佐劑即不含有分支桿菌。動(dòng)物免疫通常的免疫動(dòng)物為家兔和羊。免疫的部位多采用腳掌、腹股溝淋巴結(jié)、大腿肌肉、皮下多點(diǎn)、靜脈。免疫抗原量通常為1~10mg或50~100mg。試血及效價(jià)測(cè)定家兔的試血通常可由耳緣靜脈取血，取血量0.5ml。不同稀釋度的抗血清和1%的血細(xì)胞懸液按1:1混合，37℃保溫2h后觀測(cè)血細(xì)胞的凝聚情況，即可測(cè)得免疫血清的效價(jià)。（2）單克隆抗體單克隆抗體是建立在經(jīng)細(xì)胞融合而獲得的雜交瘤細(xì)胞基礎(chǔ)上的。所獲得的抗體具有均一的特異性。高度均質(zhì)性的特異性抗體，由一個(gè)識(shí)別單一抗原表位的B細(xì)胞克隆所分泌。一般來(lái)自雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)法&接種動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)法2、抗體的純化利用化學(xué)方法提純或濃縮某一類(lèi)的免疫球蛋白。利用免疫吸附劑和親和色譜得到免疫學(xué)上專(zhuān)一性的抗體。2023/2/749沉淀分離通過(guò)改變?nèi)芤旱臈l件或添加某種物質(zhì)，降低溶液中某一成分的溶解度，使其從溶液中沉淀析出，與其它成分分離的技術(shù)。是純化生物大分子物質(zhì)常用的經(jīng)典方法包括鹽析沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法和非離子聚合物沉淀法等。2023/2/750（一）鹽析法在物質(zhì)的水溶液中添加一定濃度的中性鹽，使物質(zhì)的溶解度減小而沉淀析出，這一過(guò)程稱(chēng)為“鹽析”。優(yōu)點(diǎn)：①成本低，不需要昂貴的設(shè)備；②操作簡(jiǎn)便，安全；③對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用；④對(duì)pH、溫度要求不嚴(yán)格。缺點(diǎn)：分離效果有限2023/2/751鹽析的基本原理蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)親水基團(tuán)、與水形成水化膜的程度、以及所帶有電荷的情況決定的。當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液中，鹽離子對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是減弱甚至消除蛋白質(zhì)分子周?chē)乃?。同時(shí)，鹽離子所帶的電荷中和部分蛋白質(zhì)分子表面電荷，更加導(dǎo)致其溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。

2023/2/752鹽類(lèi)和濃度的選擇常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等硫酸銨最為常用，其優(yōu)點(diǎn)是：溶解度大；溫度系數(shù)??；密度小，有利于析出蛋白的離心分離；蛋白沉淀物在2mol/L~3mol/L硫酸銨溶液中穩(wěn)定，低溫下可保存一年；價(jià)廉易得；分離效果比其它鹽好。但硫酸銨緩沖能力比較弱，pH難控制；銨離子干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。高濃度鹽析法是粗純樣品的常用方法。2023/2/753脫鹽

蛋白質(zhì)用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的方法有：透析法超濾法葡聚糖凝膠G50層析法。2023/2/754（二）有機(jī)溶劑沉淀法利用待分離物質(zhì)與雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過(guò)添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使某一溶質(zhì)沉淀析出，從而與其它成分分離的方法。

有機(jī)溶劑破壞溶質(zhì)分子周?chē)乃瘜樱挥袡C(jī)溶劑降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)的溶解度降低。2023/2/755優(yōu)點(diǎn)：①分辨率比鹽析法高，即一種溶質(zhì)發(fā)生沉淀的有機(jī)溶劑濃度范圍比較窄；②溶劑容易除去，并可以回收；③沉淀無(wú)需脫鹽，易于離心或過(guò)濾分離。缺點(diǎn)：①有機(jī)溶劑可使某些生物大分子變性失活，操作常需在低溫下進(jìn)行；②有機(jī)溶劑具有一定毒性。2023/2/756有機(jī)溶劑的選擇

選擇有機(jī)溶劑的原則：①有機(jī)溶劑的水溶性好；②沉淀效率高；③毒性小，避免損害工作人員的健康和污染環(huán)境；④不與溶質(zhì)分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，價(jià)格便宜。使用較多的是乙醇、丙酮、甲醇等。2023/2/757殘留的有機(jī)溶劑去除的方法：①自然蒸發(fā)或負(fù)壓蒸發(fā)，可在室溫進(jìn)行；②凝膠過(guò)濾除去。（三）離子交換層析法離子交換層系（ionexchangechromatography，IEC）是利用離子交換劑上可交換離子與組分中的離子發(fā)生可逆交換時(shí)結(jié)合力的差別，而進(jìn)行分離的一種技術(shù)。廣泛應(yīng)用于很多生命物質(zhì)的分析、制備和純化等。優(yōu)點(diǎn)：

①重現(xiàn)性好，簡(jiǎn)單易行；②分辨力強(qiáng)，回收率高；③具有多孔性，表面積大、交換容量大；④具有親水性，對(duì)大分子的吸附不牢固，層析條件溫和，不致引起物質(zhì)變性或失活。2023/2/759離子交換法的固定相是離子交換劑；若擔(dān)體帶有正電荷，可吸附著負(fù)電荷分子，則為陰離子交換法；不帶凈電荷的分子，以及陽(yáng)離子則直接流出，不會(huì)被吸附上去。這些被固相單體所吸附的離子，統(tǒng)稱(chēng)為

counterion，因?yàn)槠潆姾膳c擔(dān)體上的電荷相反(counter是"相反"的意思)

離子交換劑為人工合成的惰性高分子聚合物，其上帶有許多可電離基團(tuán)，根據(jù)這些基團(tuán)所帶電荷的不同，可分為陰離子交換劑和陽(yáng)離子交換劑。它可分三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。 基本原理2023/2/760陽(yáng)離子交換反應(yīng)：R-A-H++Y+

—R-A-X++H+

陰離子交換反應(yīng)：R-B+OH-+X-

—R-B+X-+OH-

R代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì)，A-

和B+分別代表陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合的電荷基團(tuán)，H+

和OH-分別代表陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子，Y+

和X-分別代表溶液中的離子基團(tuán)。2023/2/7612023/2/762兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類(lèi)和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。大多數(shù)蛋白在生理pH（pH6～8）下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會(huì)變性失活，應(yīng)盡量避免。

洗脫可采用改變?nèi)芤旱膒H或離子強(qiáng)度，也可同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度的方法。改變pH可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來(lái)。2023/2/763

在陰離子交換柱上血漿蛋白組分的分段洗脫NaCl(mol/L)0.01mol/LPB的pH洗脫的蛋白質(zhì)0.0258.0IgG0.0307.0IgG0.0357.0IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原0.0407.0轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原0.0457.0α2蛋白、白蛋白0.0507.0IgA、α2蛋白、白蛋白0.0606.5IgA、白蛋白0.0706.5白蛋白0.0806.5α2蛋白、β-脂蛋白、白蛋白0.0906.5α2蛋白、珠蛋白、白蛋白0.106.5α2蛋白、β-脂蛋白、珠蛋白、白蛋白0.156.5IgM、β-脂蛋白、β球蛋白0.206.5銅藍(lán)蛋白、β蛋白2023/2/764三、技術(shù)要點(diǎn)（一）離子交換劑的選擇和處理兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類(lèi)和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。大多數(shù)蛋白在生理pH（pH6～8）下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會(huì)變性失活，應(yīng)盡量避免。處理的目的：使交換劑充分溶脹，使其顆粒的孔隙增大，讓具有交換活性的電荷基團(tuán)充分暴露出來(lái)，再用酸堿浸泡，除去雜質(zhì)并使其帶上需要的反離子。

（二）裝柱和加樣選擇平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和pH時(shí)，首先要保證待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；其次是使離子交換劑與待分離物質(zhì)有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，而不與樣品中雜質(zhì)結(jié)合，以達(dá)到分離的目的。溶液的離子強(qiáng)度常用不影響蛋白質(zhì)吸附到交換劑上的最高離子強(qiáng)度液，常用的離子強(qiáng)度為20mmol/L~50mmol/LNaCl。（三）洗脫和收集洗脫可采用改變?nèi)芤旱膒H或離子強(qiáng)度，也可同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度的方法。改變pH可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。用一定鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來(lái)。（四）離子交換劑的再生與保存使其帶上所需的平衡離子。2023/2/765（四）親和層析法親和層析是利用某些生物分子之間專(zhuān)一可逆結(jié)合特性的一種高度專(zhuān)一的吸附層析類(lèi)型。配體是發(fā)生親和反應(yīng)的功能部位，也是載體和被親和分子之間的橋梁。配體本身必須有兩個(gè)基團(tuán)：一個(gè)能與載體共價(jià)結(jié)合，連接后的配體對(duì)互補(bǔ)分子的親和力不會(huì)改變一個(gè)能與被親和分子結(jié)合。2023/2/766親和層析法有點(diǎn)像在釣魚(yú)，魚(yú)是我們所要的分子(B)雜夾在一堆蛋白質(zhì)當(dāng)中，魚(yú)餌是與B具有專(zhuān)一性的分子(A,上圖1)；A與B的專(zhuān)一性很高，只會(huì)在樣本中與B結(jié)合，而排除其它雜質(zhì)(上圖2)；若把結(jié)合在吸著劑上的B溶離下來(lái)，就可以得到均質(zhì)的B(上圖3)。2023/2/767

親和層析中部分蛋白配體配基純化的物質(zhì)蛋白A/蛋白B各種免疫球蛋白單克隆抗體各種抗原、蛋白A抗原特異性單克隆抗體、特異性多克隆抗體核苷酸核苷酸結(jié)合蛋白、核苷酸酶血凝素糖蛋白蛋白酶抑制劑蛋白酶脂肪酸脂肪酸結(jié)合蛋白、清蛋白糖血凝素、糖苷甘酶生物素親和素、生物素結(jié)合蛋白肝素凝血因子、酯酶、DNA聚合酶、連接組織蛋白酶鈣調(diào)蛋白鈣調(diào)蛋白結(jié)合酶Triazine染料脫氫酶、激酶、多聚酶、干擾素、限止酶等3、特異性抗體的篩選與效價(jià)測(cè)定抗體的效價(jià)又稱(chēng)滴度，指某一物質(zhì)與一定容量的另一物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)所需要的量。免疫分析中，免疫血清中抗體的效價(jià)指將血清稀釋?zhuān)瑴y(cè)定與一定的抗原能發(fā)生反應(yīng)的最大稀釋度，此最大稀釋度即為血清的效價(jià)。常用的效價(jià)測(cè)定方法有免疫擴(kuò)散法、間接血凝法和ELISA法等。特異性抗體的篩選，制備出含不同的抗原決定簇的特異性抗原，然后根據(jù)抗體和這些抗原相互作用的強(qiáng)弱進(jìn)行分析。一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容四、免疫分析方法及其應(yīng)用放射免疫分析法（RIA）熒光免疫分析法（FIA）克隆酶給予體免疫分析法（CEDIA）酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）核醫(yī)學(xué)治療：腫瘤、甲亢等診斷體內(nèi)——PET、SPECT、放射免疫成像等體外——放射免疫分析（RIA）標(biāo)記免疫分析技術(shù)用標(biāo)記示蹤技術(shù)觀察抗原抗體一級(jí)反應(yīng)的分析方法,是體外放射分析技術(shù)中建立最早、應(yīng)用最廣的一類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)性體外放射分析技術(shù).特點(diǎn)：敏感性高，反應(yīng)時(shí)間短，可用儀器檢測(cè)結(jié)果三大標(biāo)記免疫分析技術(shù)：放射免疫、熒光免疫、酶免疫檢測(cè)方法檢測(cè)范圍生化、常規(guī)免疫mg~μg（10-3~10-6g）熒光免疫、酶免疫μg~ng（10-6~10-9g）放射免疫、發(fā)光免疫ng~pg（10-9~10-12g）PCRpg~fg（10-12~10-15g）一、放射免疫分析技術(shù)（Radioimmunoassay，RIA）

女科學(xué)家R.Yalow（美,1921~）1950’末發(fā)明（胰島素），1977年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)1.基本原理（1）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析：Ag+AbAgAb*Ag+Ab*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：2.常用標(biāo)記核素：（1）125I：γ射線(xiàn)，半衰期60天（2）3H：β射線(xiàn)，半衰期12.3年3.測(cè)量?jī)x器（1）γ計(jì)數(shù)儀（2）β液閃儀基本原理Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab結(jié)合位點(diǎn)，二者通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)方式與Ab結(jié)合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結(jié)合形成Ag*Ab復(fù)合物的放射量降低,二者變化成函數(shù)關(guān)系。

具體步驟

抗原抗體反應(yīng)結(jié)合的和游離的放射性物質(zhì)的分離放射性活度的測(cè)定柱色譜法吸附法沉淀法抗抗體發(fā)微孔濾膜法固相法求出結(jié)合率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（劑量反應(yīng)曲線(xiàn)）以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*Ab復(fù)合物為B，則B/F或B/(B＋F)與Ag的量變存在著函數(shù)關(guān)系－劑量反應(yīng)曲線(xiàn)注：T即是B與F的總和基本原理它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）二、酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。ELISA原理酶及其底物酶結(jié)合物（過(guò)碘酸鹽氧化法、戊二醛交聯(lián)法）是酶與抗體或抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應(yīng)。ELISA原理酶底物顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)

辣根過(guò)氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

ELISA的種類(lèi)和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競(jìng)爭(zhēng)法（四）雙位點(diǎn)一步法（五）捕獲法測(cè)IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn)洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體－抗原復(fù)合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加酶標(biāo)抗體生成抗體—待測(cè)抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測(cè)定

間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱(chēng)為間接法。（二）間接法包被固相載體:用已知抗原包被固相載體加待檢標(biāo)本:使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無(wú)關(guān)的物質(zhì)加酶標(biāo)抗抗體:與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體加底物顯色根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測(cè)定ELISA法間接法測(cè)定抗體1.原理（三）競(jìng)爭(zhēng)法

對(duì)照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測(cè)定管的顯色程度則隨待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的結(jié)果而異。如待測(cè)抗原量多，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。用已知特異性抗體包被固相載體測(cè)定管加待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合對(duì)照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合分別洗滌除去未結(jié)合的成分加底物顯色分別測(cè)定兩管的吸光度值，根據(jù)對(duì)照管與測(cè)定管吸光度值之比，計(jì)算標(biāo)本中待測(cè)抗原含量ELISA特點(diǎn)一：靈敏性該測(cè)定法的靈敏度來(lái)自作為報(bào)告基團(tuán)的酶。酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱(chēng)為酶放大體系。ELISA實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量。例如，在測(cè)定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí)，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10μg/ml。

特點(diǎn)二：特異性其特異性來(lái)自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。

ELISA要有三個(gè)必要的試劑，即免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。完整的ELISA試劑盒應(yīng)包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱(chēng)酶標(biāo)板）；

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶標(biāo)記物）；

（3）酶的底物；

（4）系列參考標(biāo)準(zhǔn)品（定量測(cè)定）；

（5）酶標(biāo)記物及樣本的稀釋液；

（6）洗滌液；

（7）反應(yīng)終止液。二、ELISA試劑ELISA試劑盒ELISA試劑的作用2.1免疫吸附劑：已包被抗原或抗體的固相載體，是ELISA方法中的核心試劑。固相載體：固相載體在ELISA測(cè)定過(guò)程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。專(zhuān)用于EILSA的產(chǎn)品稱(chēng)為ELISA板，國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。包被將抗原或抗體固定化的過(guò)程稱(chēng)為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過(guò)程?？贵w或蛋白質(zhì)等抗原是通過(guò)物理吸附與聚苯乙烯等固相載體結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的相互作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。載體對(duì)不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被固相載體表面剩余吸附位點(diǎn)的過(guò)程。蛋白質(zhì)抗原或抗體包被時(shí)所用的一般濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的吸附位點(diǎn)，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些吸附位點(diǎn)，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附，增加ELISA反應(yīng)得專(zhuān)一性和靈敏度。封閉的程序與包被過(guò)程相類(lèi)似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白。研究表明，脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。2.2酶標(biāo)記物即酶標(biāo)記的抗原或抗體，是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的酶標(biāo)記物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。酶標(biāo)記物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在酶?biāo)記物中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外酶標(biāo)記物還要有良好的穩(wěn)定性。在ELISA中，常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和堿性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)。2.3酶的底物2.3.1、HRP的底物

HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)，最具代表性的過(guò)氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：

DH2+H2O2D+H2O上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)

2.3.1HRP的底物OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。OPD見(jiàn)光易變質(zhì)，與過(guò)氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。TMB經(jīng)HRP作用后產(chǎn)物顯藍(lán)色，酶反應(yīng)用HCl或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為405nm。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。。

2.4.2AP的底物

AP為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。

2.5洗滌液

滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。2.6對(duì)照品陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)，確定其中不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg。陽(yáng)性對(duì)照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱(chēng)。國(guó)外檢測(cè)HBsAg的ELISA試劑盒檢測(cè)敏感度約為0.5ng/ml，陽(yáng)性對(duì)照品中含量約為10ng/ml。在對(duì)照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。2.7標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定的ELISA試劑盒應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)用的標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。1、樣品的采集與保存2、試劑的準(zhǔn)備3、包被4、加樣

在ELISA實(shí)驗(yàn)中一般有5次加樣步聚，即加標(biāo)準(zhǔn)品、加樣本、加酶標(biāo)記物、加底物、加反應(yīng)終止液。三、ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程4、保溫

在ELISA中一般加標(biāo)本和加酶標(biāo)記物后會(huì)有一次抗原抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體