生化-第十章dna的生物合成

生物化學教研室闞慕潔

第一篇生物大分子的結構與功能1第二篇物質代謝及其調節(jié)2第三篇基因信息的傳遞3

第四篇專題篇4√√？生物化學？中心法則CentralDogmaRNADNA蛋白質轉錄復制逆轉錄翻譯核苷酸序列核苷酸序列aa序列第十章DNA的生物合成4學時第十一章RNA的生物合成4學時第十二章蛋白質的生物合成4學時

復制、轉錄、翻譯講解方式：1、基本概念，所需酶及各種因子2、合成過程3、原核生物、真核生物起始延長終止

第一篇生物大分子的結構與功能1第二篇物質代謝及其調節(jié)2第三篇基因信息的傳遞3

第四篇專題篇4√√？生物化學？第十五章細胞信息轉導6學時第十六章血液生物化學2學時第十七章肝的生物化學4學時第十章DNA的生物合成(復制)DNABiosynthesis，ReplicationNormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

復制(replication)是指遺傳物質的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。親代DNA復制子代DNA復制分子基礎：堿基配對規(guī)律和DNA雙螺旋結構化學本質：酶促的生物細胞內(nèi)單核苷酸聚合復制的保證：各種酶和蛋白質因子的參與NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

本章內(nèi)容

復制的基本規(guī)律

DNA復制的酶學和拓撲學變化復制的過程逆轉錄和其他復制方式

DNA損傷（突變）與修復NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

復制的基本規(guī)律BasicRulesofDNAReplication

第一節(jié)NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

半保留復制semi-conservativereplication半不連續(xù)復制semi-discontinuousreplication復制方向為雙向bidirectionalreplication高保真性復制highfidelity復制的基本規(guī)律復制的基本規(guī)律：(4個)半保留復制雙向復制半不連續(xù)復制高保真復制NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

一、半保留復制

DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全重新合成。兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復制方式稱為半保留復制。NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

半保留復制的理論設想TGGTACTGCCACTGGACCATGACGGTGACCTGGTACTGCCACTGGACCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCTGGTACTGACCATGACACCATGACTGGTACTGTGGTACTGCCACTGGACCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復制過程中形成復制叉子代DNA

子鏈繼承母鏈遺傳信息的

幾種可能方式全保留半保留混合式親代DNA子代DNA半保留復制的證明——實驗細菌可以利用NH4Cl作氮源合成DNA輕鏈14N-DNA重鏈15N-DNA輕、重鏈DNA混合半保留復制第一代DNA半保留復制第二代DNA半保留復制第三代DNA細菌在含NH4Cl的普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)后提取DNA把細菌放在含15NH4Cl的培養(yǎng)液中培養(yǎng)若干代后提取含15N的“重”DNA把含15N-DNA的細菌放回含NH4Cl的普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)20分鐘后提取子一代DNA把含15N-DNA的細菌在含NH4Cl的普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)40分鐘后提取子二代DNA將輕鏈DNA和重鏈DNA混合把含15N-DNA的細菌在含NH4Cl的普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)60分鐘后提取子三代DNA普通培養(yǎng)液培養(yǎng)細菌的輕鏈DNA在密度梯度離心時區(qū)帶在離心管上方子二代DNA密度梯度離心分析時有介于重帶與輕帶之間的中間帶輕帶兩種將輕鏈和重鏈DNA混合后密度梯度離心時在離心管中有與輕、重鏈對應的兩條區(qū)帶子三代DNA密度梯度離心分析時仍有中間帶和輕帶兩種，以后各代DNA分子密度梯度離心結果相同，但輕帶變濃而中間帶逐漸被稀釋。含15NH4Cl培養(yǎng)液培養(yǎng)的重鏈DNA在密度梯度離心時區(qū)帶在離心管下方子一代DNA密度梯度離心分析時致密帶介于重帶與輕帶之間，沒有單獨的重帶和輕帶實驗結果說明子一代DNA雙鏈中一股是15N單鏈，從親代接受和保留下來的；另一股是14N單鏈，完全是新合成的。Messelson和Stahl的實驗支持半保留復制。NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

1、遺傳的保守性：子代保留了親代的全部遺傳信息。

半保留復制的意義2、遺傳的保守性是相對的，自然界存在著普遍的變異現(xiàn)象。NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為雙向復制。二、雙向復制NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

復制中的放射自顯影圖象（眼睛狀圖形）（大腸桿菌DNA經(jīng)放射性標記后電鏡下觀察結果）(一）原核生物：一個復制起始點，一個終止點NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

DirectionalityoftheDNAstrandsatareplicationforkForkmovement復制叉指的是DNA雙鏈分成兩股各自作為模板，子鏈沿模板延長形成的Y字形結構（二）真核生物:多染色體，多起始點，多復制子復制子(replicon):是獨立完成復制的功能單位，是從一個DNA復制起始點起始的DNA復制區(qū)域，包括復制起點和終點。高等生物有數(shù)以萬計的復制子，長度差異很大。原核生物是單復制子復制，稱為復制體（replisome）NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

真核生物的多復制子復制5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’復制進程5’5’3’3’NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

E.coli人染色體基因組4.4×106bp

3×109bp1個復制起點和兩個復制叉

多個復制起點和多個復制叉

單復制子

多復制子（104～105）42分鐘

8小時1000bp/秒

100bp/秒53解鏈方向3′5′領頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)353′3′5′5′領頭鏈連續(xù)復制隨從鏈不連續(xù)復制DNA復制方向：53三、復制的半不連續(xù)性岡崎片段NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

領頭鏈(leadingstrand)：順著解鏈方向生成的子鏈，

復制是連續(xù)進行的隨從鏈(laggingstrand)：另一股鏈因為復制的方

向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延

長，這股不連續(xù)復制的鏈三、復制的半不連續(xù)性岡崎片段(okazakifragment)：復制中的不連續(xù)片

段稱為岡崎片段。NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

第二節(jié)

DNA復制的酶學和拓撲學變化TheEnzymologyofDNAReplicationNormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

參與DNA復制的物質DNA復制系統(tǒng)底物dNTP聚合酶DNA-pol模板解成單鏈單鏈的DNA母鏈引物與模板互補的RNA片段其它酶和蛋白質因子底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依賴DNA的DNA聚合酶簡寫為DNA-pol模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合解螺旋酶引物酶單鏈DNA結合蛋白DNA連接酶等一、復制的基本化學反應單鏈延長的方向(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi

新鏈生成需引物；新鏈的延長只可沿5→3方向進行。脫氧核糖核苷酸之間生成3，5－磷酸二酯鍵而逐一聚合5′端3′端AOCH2OHPOOO-O5'COCH2POOO-O3'5'TOCH2POOO--O3'5'5′端到3′端核苷酸/堿基的排列順序3'，5'磷酸二酯鍵二、DNA聚合酶（DNApolymerase）簡稱：DNA-pol全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase，DDDP)ⅠⅡⅢ種類：原核αβ

γ

δ

ε真核NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

1、聚合活性：

5

3方向，催化四種dNTP一個一個地連接到DNA子鏈上去。2、核酸外切酶活性（兩種情況）

35外切酶活性，能辨認錯配的堿基對，并將其水解。53外切酶活性，能切除突變的DNA片段。NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

DNA聚合酶活性（作用）（2方面）

核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性：切除錯配的核苷酸5′→3′外切酶活性：切除引物切除突變的片段？（一）原核生物的DNA聚合酶分三型：

DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ相同點：

1、53

的聚合活性

2、35

核酸外切酶活性NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

原核生物的DNA聚合酶不同點DNApolⅢ的比活性遠高于DNApolⅠ，是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。FromLehninger'sPrinciplesofBiochemistry4th小片段

大片段（Klenowfragment）5'→3'聚合功能，3'→5'外切酶活性5'→3'外切酶活性EJPNMLHIORQGCDBFAKDNApolⅠ木瓜蛋白酶H和I螺旋之間有較大的非螺旋區(qū)50個氨基酸DNApolⅠ的作用1.對復制中的錯誤進行校讀和切除；2.填補復制和修復過程中出現(xiàn)的空隙；3.試管內(nèi)合成DNA的常用DNApolⅠ。NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因發(fā)生突變，細菌依然能存活它參與DNA損傷的應急狀態(tài)修復（SOS修復）NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

全酶組裝至模板，增強核心酶活性功能：原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ核心酶5’→3’聚合活性3‘→5’外切酶活性夾穩(wěn)模板，滑動DNA-polⅢ（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol：在線粒體DNA復制中起催化作用。DNA-pol（Ⅲ）：延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。DNA-pol（Ⅰ）：校讀、修復和填補缺口DNA-pol：起始引發(fā)，有引物酶活性。DNA-pol（Ⅱ）：參與低保真度的復制，應急修復。3’→5’外切酶活性（、、）NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

三、復制保真性的酶學依據(jù)

復制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能準確傳代的基本原理。

酶學機制保證復制的保真性：（一）核酸外切酶活性在復制中辨認切除錯配堿基并加以校正

（二）復制的保真性依賴正確的堿基選擇NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

（一）核酸外切酶活性在復制中辨認切除錯配堿基并加以校正

B：如果堿基配對正確，DNA-polI則不表現(xiàn)外切酶活性；只表現(xiàn)聚合酶活性。DNA-pol

I外切活性聚合活性dCTPA：堿基配對錯誤，DNA-polI表現(xiàn)外切酶活性，切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物模板鏈新合成鏈模板鏈

新合成鏈（二）復制的保真性依賴正確的堿基選擇

DNA聚合酶靠其大分子結構協(xié)調非共價（氫鍵）與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。

氫鍵

磷酸二酯鍵DNA復制的精確度極高,在細菌中其誤差率只有10-8～10-10NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

DNA聚合酶Ⅲ對核苷酸的參入有選擇功能。DNA聚合酶Ⅲ對嘌呤的構型表現(xiàn)不同的親和力，從而實現(xiàn)其選擇作用。亞基具有堿基選擇功能。?嘌呤的化學結構能形成順式和反式構型，與相應的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應處于反式構型。

反式順式NNNNNP-RHH69NNNNNR-PHH69（二）復制的保真性依賴正確的堿基選擇2.聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能1.遵守嚴格的堿基配對規(guī)律3.復制出錯時DNA-pol的及時校讀功能DNA復制的保真性至少要依賴三種機制

染色體是由DNA和組蛋白經(jīng)高度壓縮形成的復雜結構。DNA復制時，首先需要把DNA的超螺旋解開。

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。四、復制中的解鏈伴有DNA分子拓撲學變化NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定狀態(tài)原核生物復制起始的相關蛋白質DnaA(dnaA)辨認起始點DnaC(dnaC)運送并協(xié)同DnaB拓撲異構酶（gyrA,B）理順DNA鏈單鏈DNA結合蛋白SSB穩(wěn)定已解開的單鏈解螺旋酶DnaB(dnaB)解開DNA雙鏈引物酶DnaG(dnaG)催化RNA引物生成1.解螺旋酶(helicase)解螺旋酶DnaADnaA、B、C…ATP作用：利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。CBA2.單鏈DNA結合蛋白（SSB）作用:1、防止單鏈DNA重新形成雙鏈

2、防止單鏈DNA被核酸酶水解特點：由177個aa組成的同源四聚體，結合單鏈

DNA跨度約32bp,不斷地結合和解離。DnaB單鏈DNA結合蛋白

作用：該酶以DNA為模板，合成一段RNA引物。

DNA復制是在該引物3’-OH末端加入dNTP。

因為DNA聚合酶不能催化兩個游離的dNTP聚合，而引物酶可以催化兩個游離的NTP聚合.3.引物酶(primase)為什么要合成引物???NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

Fig.11.9a(TEArt)AbletocovalentlylinktogetherUnabletocovalentlylinkthe2individualnucleotidestogetherPrimer5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’DNAPolymeraseCannotInitiatenewStrands引物酶和RNA聚合酶的異同1、相同點：催化游離NTP聚合2、不同點：引物酶RNA聚合酶

利福平（—）NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

拓撲異構酶對DNA分子的作用是既能切開又能連接磷酸二酯鍵，使DNA不至于打結，適當時候又把切口封閉，使DNA的拓撲異構體發(fā)生改變。拓撲異構酶拓撲異構酶Ⅰ拓撲異構酶Ⅱ拓撲異構酶Ⅲ原核原核真核真核轉軸酶解纏酶切口-封閉酶松弛酶ω蛋白旋轉酶又分為幾種亞型最近發(fā)現(xiàn)（二）DNA拓撲異構酶

(DNAtopoisomerase)DNA分子是反向平行、右手螺旋的雙鏈結構。每一個螺旋有10個堿基對，螺距為3.4nm。堿基垂直螺旋軸居雙螺旋內(nèi)側，與對側堿基形成氫鍵配對（互補配對形式：A=T;GC）。疏水作用力和氫鍵共同維持著DNA雙螺旋結構的穩(wěn)定。

DNA雙螺旋結構具有特征性（Watson,Crick,1953）DNA的超螺旋結構超螺旋結構(superhelix或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結構。正超螺旋(positivesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同負超螺旋(negativesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反正超螺旋的形成11個螺旋9個螺旋被壓縮

超螺旋局部解開后DNA復制過程中正超螺旋的形成2

復制過程中正超螺旋的形成

超螺旋解開前29拓撲異構酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結；適當時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應不需ATP。拓撲異構酶Ⅱ無ATP時，切斷處于正超螺旋的DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。再利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。拓撲異構酶的作用

NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。五、DNA連接酶(DNAligase)DNA連接酶的特點:1、消耗ATP;2、只能連接堿基互補基礎上的雙鏈中的單鏈缺口（不能連接單獨存在的DNA或RNA單鏈）。NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

DNA連接酶ATPADPHO5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’ATPADPDNA連接酶5’3’5’3’DNA連接酶的功能1、在復制中起最后接合缺口的作用；2、在DNA修復、重組及剪接中起縫合缺口作用；3、基因工程的重要工具酶。NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

復制叉的結構及參與復制的酶與因子DNA生物合成過程第三節(jié)TheProcessofDNAReplicationNormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

一、原核生物的DNA生物合成

（一）復制的起始（二）復制的延長（三）復制的終止NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

（一）復制的起始：DNA解鏈形成引發(fā)體1.DNA解開成單鏈，形成復制叉，提供模板3.合成引物，提供3-OH末端2.形成引發(fā)體NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

E.Coli

基因圖umuC,DdnaCdnaGdnaLmutHmutSdnaZmutLdnaIdnaAdamrpoA,DoriCmutDpolCmutTpolBdnaJ,KterreprecCrecBrecDgyrAgyrBrecAliguvCuvBpolAdnaPmutUuvDdnaBssbrpoB,CuvA0/100102030405060708090oriC在82分鐘位點跨度為245bpE.coli復制起始點oriC，跨度為245bpGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復序列

反向重復序列53531.DNA解鏈DnaA、B、C三種蛋白參與解鏈過程DnaB解螺旋酶DnaCDnaA蛋白四個相同亞基組成SSB消耗ATP3553DnaB解螺旋酶DnaCSSB含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。

DnaG引物酶DNA拓撲異構酶Ⅱ2.引發(fā)體和引物引物的合成3553DnaB解螺旋酶DnaCSSBDNA拓撲異構酶Ⅱ合成引物DnaG引物酶解鏈方向1、引物：短鏈RNA分子2、合成方向：5’→3’3、提供3-OH末端（二）復制的延長領頭鏈：連續(xù)隨從鏈：不連續(xù)半不連續(xù)復制NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

復制的延長指在DNA-polⅢ催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polⅢ復制的延長領頭鏈的合成隨從鏈的合成1000-2000合成方向5’3’解鏈方向1、領頭鏈復制先于隨從鏈2、兩鏈在同一酶催化下進行延長DNA-polⅢ（三）復制的終止切除引物：RNA酶填補空隙：DNA-PolI連接切口：DNA連接酶

NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制的復制片段在復制的終止點(ter)處匯合。岡崎片斷的連接55DNAPol-ⅠRNA酶水解RNA引物留下空隙填補引物水解后留下的空隙，保留缺口DNA連接酶DNA連接酶ATPADP+Pi55DNA連接酶55P形成磷酸二酯鍵連接片段之間缺口復制過程簡圖（一）復制的起始（二）復制的延長（三）復制的終止注意：原核生物E.Coli

的DNA是環(huán)狀雙鏈；真核生物為線狀雙鏈DNA。二、真核生物的DNA生物合成

復制時間：分裂間期的S期NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

細胞周期（cellcycle）是指連續(xù)分裂細胞從一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂結束所經(jīng)歷的整個過程。

整個過程中，細胞遺傳物質復制并加倍，且在分裂結束時平均分配到兩個子細胞中去。

細胞周期分期細胞周期又可以分為間期（interphase）：又分為G1期、S期和G2期。

從一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂開始的時期就是間期。間期在光學顯微鏡下看不到細胞有明顯的變化，但細胞內(nèi)卻正在進行一系列的生化活動，主要的活動圍繞制造完全相同的又一套遺傳物質展開。這一期以DNA合成為標志。有絲分裂期(Mphase)。在光學顯微鏡下可以看到的只是M期，經(jīng)過分裂期，加倍的染色體和其他細胞組分被平均分配到兩個完全一樣的子細胞中。換句話，通過分裂，形成了一個新細胞。G1期又稱為DNA合成前期（準備時期)，此期DNA的合成還沒有開始，但此期中所進行的RNA和蛋白質合成卻是DNA復制所必須的，而且，S期中DNA合成的啟動也在這一時期受到調控。S期中，DNA進行合成，同時合成染色體形成所必需的組蛋白、非組蛋白等物質。G2期主要合成一些與有絲分裂中新細胞形成所必需的物質，如細胞骨架中的微管蛋白等。M期中，細胞染色體形成并發(fā)生細胞分裂，新細胞在此期形成。細胞周期示意圖

打開雙鏈形成復制叉引發(fā)體RNA引物多染色體、多起始點、多復制子復制起始點：oriC短、富含AT序列復制有時序性：特點自主復制序列(ARS)（一）真核生物復制的起始

——與原核生物基本相似復制子以分組方式激活而不是同步啟動轉錄活性高的DNA在S期早期就開始復制衛(wèi)星DNA（高度重復序列）、中心體（連

接染色體雙倍體的部位）、端粒（線性染

色體兩端）在S期最后復制

引物酶：DNA-Polα

解螺旋酶：DNA-Polδ

增殖細胞核抗原（PCNA）復制因子（RF）拓撲酶復制起始需要的一些酶和因子NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關鍵點。G1→S及G2→M的調節(jié)，與蛋白激酶活性有關。?蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調控作用。相關的蛋白激酶具有四級結構的蛋白質，有兩類亞基：調節(jié)亞基——細胞周期蛋白（cyclin）催化亞基——細胞周期蛋白依賴激酶（cyclindependentkinase，CDK）二者都有多種，而且可以交叉配伍，實現(xiàn)對DNA復制的多樣化和精確的調節(jié)。哺乳類動物細胞內(nèi)還發(fā)現(xiàn)天然抑制CDK的蛋白：錨蛋白（ankynin）——抑制CDK4P21蛋白——抑制多種CDK，還抑制PCNA，還參加P53介導的細胞凋亡級聯(lián)反應。P21和錨蛋白被稱為細胞檢查點蛋白。引物核小體（二）真核生物復制的延長延長的主要酶：DNA-Polδ延長過程：α和δ互換引物、岡崎片段比原核生物短隨從鏈領頭鏈親代DNA復制延長的總結在復制叉及引物形成后，DNA-Polδ通過

PCNA的協(xié)同作用，逐步取代DNA-Polα，

在RNA引物的3’-OH上連續(xù)合成子鏈；真核生物以復制子為單位進行復制，其

引物和岡崎片段都比原核生物的短；真核生物岡崎片段的長度大致與一個核

小體所含DNA的量或其若干倍相等；真核生物DNA-Pol的催化效率遠比原核

生物慢，但復制的整體速度不慢。（三）真核生物復制的終止切除引物：RNA酶、核酸外切酶填補空隙：DNA-Polδ/片段連接：連接酶(岡崎片段、復制子）

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真核生物DNA復制與核小體組裝同步進行，復制完成后隨即組裝成染色體并從G2過渡到M期。染色體DNA呈線狀，復制在末端停止。復制中岡崎片段的連接，復制子之間的連接都可以在線性DNA內(nèi)部完成。染色體兩端DNA子鏈上最后復制的RNA引物，去除后留下空隙。剩下的DNA單鏈要填補成雙鏈，否則會被核內(nèi)的DNase水解變短。（三）真核生物復制的終止NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

線性DNA復制的末端復制完成后子鏈末端留下空隙，母鏈成單鏈問題？？？線性染色體兩端DNA子鏈上，5’端RNA引物去除后留下空隙該如何填補？已知：1、DNA-Pol

不能催化兩個游離的dNTP聚合2、DNA單鏈的母鏈易被DNase水解。（四）染色體末端復制——端粒酶NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

端粒(telomere)由端粒酶催化,在真核線性DNA的末端形成一種特殊的結構并與蛋白質結合成端粒。功能?

維持染色體的穩(wěn)定性?

維持DNA復制的完整性

結構特點?

由末端單鏈DNA序列和蛋白質構成。?

該序列是多次重復的富含T、G堿基的短序列（TnGn）x。TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒酶(telomerase)

端粒酶RNA（An、Cn）x(hTR)

AAAACCCCAAAACCCC...

端粒酶協(xié)同蛋白(hTP1)

端粒酶逆轉錄酶(hTRT)

功能：提供RNA模板、催化逆轉錄端粒酶通過爬行模型的機制維持染色體的完整組成NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

端粒酶的RNA端粒DNA末端內(nèi)在模板RNA端粒酶的RNA端粒酶的RNADNA-Pol端粒酶靠其hTR（AnCn）x

辨認及結合母鏈DNA（TnGn）x的重復序列并結合至其3’端，開始以逆轉錄的方式復制延伸母鏈。復制一段后，hTR（AnCn）x

爬行移位至新合成的母鏈3’端再以逆轉錄的方式繼續(xù)復制延伸母鏈。延伸至足夠長度后，端粒酶脫離母鏈，代之以DNA-pol，此時母鏈形成非標準的G-G發(fā)夾結構允許其3’-OH反折，同時起引物和模板的作用，在DNA-pol的作用下完成末端雙鏈的復制。逆轉錄和其他復制方式第四節(jié)NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

逆轉錄酶(reversetranscriptase)

全稱：依賴RNA的DNA聚合酶

逆轉錄(reversetranscription)RNADNA

逆轉錄酶

一、逆轉錄病毒和逆轉錄

NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

逆轉錄酶的作用

RNA模板逆轉錄酶DNA-RNA雜化雙鏈逆轉錄酶(RNaseH)單鏈DNA逆轉錄酶雙鏈DNA是多功能酶，有三種酶活性：

逆轉錄酶：逆轉錄活性：以RNA為模板合成DNA

RNase活性：水解RNA:DNA中的RNADNApol活性：以DNA為模板合成DNANormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

分子生物學研究可應用逆轉錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈。試管內(nèi)合成cDNAcDNAcomplementaryDNA逆轉錄酶SI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解AAAAAAAATTTTTTTT滾環(huán)復制(rollingcirclereplication)是某些低等生物的復制形式，如X174和M13噬菌體等。不需引物。D環(huán)復制(D-loopreplication)是線粒體DNA(mtDNA)的復制形式。需引物。二、滾環(huán)復制和D環(huán)復制NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

滾環(huán)復制OH-3′P-5′A蛋白（具有核酸內(nèi)切酶活性，在復制起點外環(huán)打開缺口）滾動成新環(huán)P-5′3′3′5′P-5′3′5′3′5′3′5′3′5′閉環(huán)單鏈為模板，邊滾動邊連續(xù)復制打開的外環(huán)單鏈不連續(xù)復制dNTPDNA-polγ

D環(huán)復制第一引物以內(nèi)環(huán)為模板延伸第二引物（反向）以外環(huán)為模板進行反向延伸DNA損傷（突變）與修復DNADamage(Mutation)andRepair第五節(jié)NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

由遺傳物質結構改變而引起的遺傳信息改變，稱突變，又稱DNA損傷。突變的實質：個別dNMP殘基或片段DNA在構成、復制或表型功能的異常變化。

DNA損傷（突變）NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

一、突變的意義（一）突變是進化、分化的分子基礎（二）突變導致基因型改變（三）突變導致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎

突變就其后果而言并非都是危害生命的，也有積極意義，且在生物界普遍存在。NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

二、引發(fā)突變的因素

物理因素紫外線(ultraviolet,UV)

各種輻射UV可以導致DNA分子上相鄰的兩個嘧啶堿基發(fā)生共價交聯(lián)，生成嘧啶二聚體。NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

物理因素：紫外線(UV)、各種輻射

UV胸腺嘧啶二聚體二、引發(fā)突變的因素

物理因素紫外線(ultraviolet,UV)

各種輻射UV可以導致DNA分子上相鄰的兩個嘧啶堿基發(fā)生共價交聯(lián)，生成嘧啶二聚體?；瘜W因素很多的化學誘變劑同時就是致癌劑。NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

三、引起突變的分子改變類型有多種

錯配(mismatch)

缺失(deletion)

插入(insertion)

重排(rearrangement)

框移(frame-shift)

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DNA分子上的堿基錯配稱點突變。

(pointmutation)

自發(fā)突變化學誘變點突變發(fā)生在基因的編碼區(qū)，可導致氨基酸改變。

（一）錯配DNA上某一堿基的置換NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

與疾病有關的點突變例子

鐮型紅細胞貧血β基因（編碼鏈GAG→GTG）谷aa纈aa鐮型貧血基因與血紅蛋白的改變HbAβ肽鏈：N-val-his-leu-thr-pro-glu-glu----C（146）HbSβ肽鏈：N-val-his-leu-thr-pro-val-glu----C（146）HbSβ基因：CACGTG模板鏈編碼鏈HbAβ基因：CTCGAG模板鏈編碼鏈正常血紅蛋白鐮型貧血6Glu→ValHbS=α

β22（β鏈）與疾病有關的點突變例子

鐮型紅細胞貧血β基因（編碼鏈GAG→GTG）

膀胱癌c-rasH基因（編碼鏈GGC→GTC）谷aa纈aa甘aa纈aa膀胱癌細胞 c-rasH基因點突變細胞株EJ/T24基因：CAGGTC模板鏈編碼鏈CCGGGC模板鏈編碼鏈正常細胞基因：P產(chǎn)物（正常）：---------gly12-----gln61----ras21P產(chǎn)物（膀胱癌）：------val12---------------ras21（二）缺失、插入和框移突變

缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。

插入：

原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。

框移突變是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質氨基酸排列順序發(fā)生改變。NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

正常缺失C3′……5′……GAGAUUAUGCCC丙纈組纈谷酪蛋絲5′3′正?！瑼GAUUGAUGCCC丙纈組纈缺失使閱讀框前移插入使閱讀框后移缺失或插入點以后的密碼全部改變（三）重排

DNA分子內(nèi)較大片段的交換稱重組或重排。NormanBethunecollegeofMedicine闞慕潔，Ph.D.,Dept.ofBiochemistry

四、DNA損傷的修復修復(repai