擬南芥銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtAMT13的電生理功能

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材料與方法

1.1材料

擬南芥（Arabidopsis）、大腸桿菌DH5α和蛙卵表達(dá)載體pCI由筆者所在測(cè)驗(yàn)室保存，非洲爪蟾由筆者所在測(cè)驗(yàn)室飼養(yǎng)；PCR擴(kuò)增高保真酶PrimeSTAR購(gòu)自TaKaRa公司；T4連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ購(gòu)自NEB公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；膠原酶A購(gòu)自Roche公司；電生理用試劑購(gòu)自Ameresco公司；雙電極電壓鉗設(shè)備購(gòu)自Axon公司。放大器型號(hào)為pClamp900A，數(shù)模轉(zhuǎn)換型號(hào)為Digidata1440，質(zhì)粒注射儀器型號(hào)為Nanoliter2000。

1.2AtAMT1.3開(kāi)放閱讀框的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建

取凍存的擬南芥樣品約100mg，液氮研磨，根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA第1鏈，AtAMT1.3序列登錄號(hào)為At3g24300.1。以cDNA為模板，舉行PCR擴(kuò)增。引物序列：P1，5′-GTCGAATTCATGTCAGGAGCAATAACATGC-3′；P2，5′-GTCTCTAGATTAAACGCGAGGAGGAGTAGC-3′。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃1min，53℃1min，72℃1.67min，24個(gè)循環(huán)；72℃延遲10min。割膠回收，將產(chǎn)物“3′-”端加A尾后連到PMD19-Tvector，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，陽(yáng)性克隆送往華大基因科技有限公司測(cè)序。用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ將測(cè)序正確地克隆切下來(lái)，通過(guò)T4連接酶連入蛙卵表達(dá)載體pCI。

1.3注射蛙卵及電生理檢測(cè)

首先，將蛙卵從非洲爪蟾中取出，用1mg/mL膠原酶A消解1.5～2.0h，然后挑揀健康的單個(gè)蛙卵保存于ND96溶液中，其中ND96溶液成分包括96mmol/LNaCl、2mmol/LKCl、1.8mmol/LCaCl2、1mmol/LMgCl2、5mmol/LHEPES（用NaOH調(diào)pH值至7.4）。將59.8nL的質(zhì)粒pCI-OsAMT1.3注射進(jìn)入健康的蛙卵，同等體積的無(wú)菌水注射進(jìn)入蛙卵，作為對(duì)照。將蛙卵置于ND96溶液（2.5mmol/L丙酮酸鈉）中，19℃培養(yǎng)3d，檢測(cè)。蛙卵鉗置于-70mV中，利用連續(xù)ramp記錄。膜電位施加程序的電壓為-140～20mV，與之前的報(bào)道一樣，注射水的蛙卵對(duì)1mmol/LNH4+或10mmol/LMeA+不敏感[12]。電生理用根本溶液成分包括100mmol/LNaCl、2mmol/LCaCl2、2mmol/LMgCl2、4mmol/LTris（用MES調(diào)pH值至7.4），NH4Cl或者M(jìn)eACl根據(jù)圖表的指示添加。在做離子選擇性試驗(yàn)時(shí)，根本溶液中的NaCl換成一致濃度的CholineCl。

2結(jié)果與分析

2.1AtAMT1.3-pCI載體的構(gòu)建

以擬南芥cDNA為模板，以P1、P2為引物舉行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為1497bp目的片段（圖1），割膠回收，連入PMD19-Tvector載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、測(cè)序得到正確的AtAMT1.3-PMD19-T，用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切AtAMT1.3-PMD19-T和pCI，割膠回收AtAMT1.3片段和pCI大片段，通過(guò)T4連接酶連接目的片段和大載體片段，轉(zhuǎn)化后篩選獲得陽(yáng)性質(zhì)粒AtAMT1.3-pCI，酶切驗(yàn)證正確后濃度濃縮至>1μg/μL，備用（圖2），AtAMT1.3-pCI質(zhì)粒構(gòu)成見(jiàn)圖3。

2.2AtAMT1.3的氨基酸序列分析

氨基酸序列分析說(shuō)明，AtAMT1.3在進(jìn)化上與AtAMT1.5親緣關(guān)系最近，AtAMT1.1次之（圖4）。它們都屬于AMT-1亞家族，其中AtAMT1.3與AtAMT1.2之間的親緣關(guān)系在該亞家族內(nèi)部最遠(yuǎn)（圖4）?；贏tAMT1.1和AtAMT1.2已較

為領(lǐng)略的功能特征[11，13-15]舉行預(yù)料，結(jié)果顯示，AtAMT1.3在功能特征方面的表現(xiàn)與AtAMT1.1相近，而與AtAMT1.2差異較大。

2.3AtAMT1.3的離子選擇性

在-70mV下添加1mmol/L堿性陽(yáng)離子Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+入電生理根本溶液，對(duì)AtAMT1.3介導(dǎo)的電流沒(méi)有明顯影響，而用1mmol/LNH4+灌流能產(chǎn)生大幅內(nèi)向的電流（圖5-a），說(shuō)明AtAMT1.3是一個(gè)高度選擇性的銨吸收系統(tǒng)。這種高度銨的選擇性在整個(gè)電壓區(qū)間內(nèi)（-140～20mV）皆是如此（圖5-b），說(shuō)明AtAMT1.3對(duì)銨吸收的高度選擇性是不憑借于膜電位的。

2.4AtAMT1.3的銨濃度響應(yīng)

在-70mV下，AtAMT1.3介導(dǎo)的內(nèi)向銨電流隨著銨濃度的增加而增加，在<400μmol/L的銨濃度下，電流急劇增大；而在1000μmol/L下，接近飽和，說(shuō)明AtAMT1.3介導(dǎo)的銨吸收具有濃度憑借性（圖6-a）；AtAMT1.3介導(dǎo)的內(nèi)向銨電流睡著膜電位的增加而增加，說(shuō)明AtAMT1.3的銨吸收具

有電壓憑借性（圖6-b）。通過(guò)米氏方程擬合得到AtAMT1.3介導(dǎo)的銨吸收在1mmol/L左右達(dá)成飽和（圖6-c）。在-140mV下，Km值（達(dá)成1/2最大吸收速率時(shí)的銨濃度）為（18.1±2.8）μmol/L；在-130mV下，Km值為（21.4±3.01）μmol/L；在-120mV下，Km值為（25.5±3.2）μmol/L；在-110mV下，Km值為（28.2±3.5）μmol/L；在-100mV下，Km值為（35.0±3.5）μmol/L；在-90mV下，Km值為（44.6±4.0）μmol/L；在-80mV下，Km值為（57.8±5.2）μmol/L，由此可見(jiàn)Km值具有電壓憑借性，即膜電位越正，Km值越大，說(shuō)明銨是以離子的形態(tài)進(jìn)入細(xì)胞膜的（圖6-d）。假設(shè)在膜內(nèi)有1個(gè)NH4+的結(jié)合位點(diǎn)，那么這個(gè)位點(diǎn)應(yīng)位于整個(gè)膜電場(chǎng)52%的位置。

2.5AtAMT1.3的甲基銨濃度響應(yīng)

甲基銨是銨的同系物，廣泛應(yīng)用于AMT的功能研究。在-70mV下，AtAMT1.3介導(dǎo)的內(nèi)向甲基銨電流也具有濃度憑借性，即隨著甲基銨濃度的增加而增加，在銨濃度<7.5mmol/L下，電流急劇增大；而在胺濃度為10mmol/L下，電流接近飽和（圖7-a）。AtAMT1.3介導(dǎo)的內(nèi)向甲基銨具有電壓憑借性，即膜電位越負(fù)，電流越大（圖7-b）。通過(guò)米氏方程擬合得到甲基銨親和力常數(shù)Km值在毫摩爾級(jí)：在-140mV下，Km=（2.5±0.1）mmol/L；在-130mV下，Km=（2.9±0.1）mmol/L；在-120mV下，Km=（3.3±0.2）mmol/L；在-110mV下，Km=（3.8±0.2）mmol/L；在-100mV下，Km=（4.4±0.2）mmol/L；在-90mV下，Km=（5.1±0.3）mmol/L；在-80mV下，Km=（5.7±0.4）mmol/L。Km值具有電壓憑借性，即膜電位越正，Km值越大（圖7-c），說(shuō)明甲基銨是以離子的形態(tài)進(jìn)入細(xì)胞膜的。假設(shè)在膜內(nèi)有1個(gè)MeA+的結(jié)合位點(diǎn)的話(huà)，那么這個(gè)位點(diǎn)應(yīng)位于整個(gè)膜電場(chǎng)34%的位置。

2.6AtAMT1.3的pH值響應(yīng)

在-70mV下，AtAMT1.3介導(dǎo)的銨電流不受外界pH值調(diào)控，即酸性條件和接近中性的pH值對(duì)銨電流根本沒(méi)有影響（圖8-a）。在不同膜電位下，AtAMT1.3介導(dǎo)的銨電流皆不受pH值調(diào)控（圖8-b、圖8-c）。

3結(jié)論與議論

在同一氮素水平供給下，擬南芥對(duì)銨的吸收速率是硝的20倍[1]，說(shuō)明銨態(tài)氮對(duì)其生長(zhǎng)極其重要，植物的銨吸收是由AMT介導(dǎo)完成的[2-4]。AtAMT1.3雖然付出于根部的銨吸收，但是其功能特征如對(duì)銨吸收專(zhuān)一與否、對(duì)膜電位的響應(yīng)、不同電壓下的親和力、運(yùn)輸機(jī)理等還不領(lǐng)會(huì)。本研究結(jié)果說(shuō)明，AtAMT1.3是一個(gè)典型的高度選擇性的、高親和銨吸收系統(tǒng)（圖5、圖6），其Km值為25μmol/L，與AtAMT1.1的Km值很接近[13]，但與AtAMT1.2差距很大[11]。AtAMT1.3與AtAMT1.1親緣性近，而與AtAMT1.2遠(yuǎn)（圖4），再根據(jù)布局抉擇功能的原理可知，這種Km值的差異反映了AtAMT1.3與AtAMT1.1的好像性。AtAMT1.3不僅能通透NH4+，也能通透NH4+的同系物MeA+，但其對(duì)MeA+的通透性要低，親和力降低了約100倍（圖7），這與大多數(shù)報(bào)道的AMT-1亞家族的銨轉(zhuǎn)運(yùn)類(lèi)似[11，16-17]。AMT既能通透NH4+、又能通透MeA+的種特性有利于對(duì)AMT功能特征的研究，如在酵母表達(dá)系統(tǒng)中，通過(guò)14C標(biāo)記的MeA來(lái)研究AMT的吸收以及親和特征[18-19]。

盡管AMTs在布局上同源性很高，但其轉(zhuǎn)運(yùn)底物和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理卻大不一致[12]，甚至對(duì)一致的AMT提出不同的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。Khademi等通過(guò)解析大腸桿菌EcAmtB晶體布局提出該蛋白結(jié)合的是NH4+，但是最終運(yùn)輸?shù)氖荖H3[20]。由于記錄得到了離子態(tài)的NH4+內(nèi)流，這個(gè)NH3運(yùn)輸?shù)挠^(guān)點(diǎn)受到挑戰(zhàn)[21]。對(duì)于植物AMT，研究者們根據(jù)一系列的試驗(yàn)證據(jù)提出了4種運(yùn)輸機(jī)制：如番茄LeAMT1.1、水稻OsAMT1.1的運(yùn)輸機(jī)制是NH4+單向運(yùn)輸[16-17]；擬南芥AtAMT1.2、小麥TaAMT1.1的運(yùn)輸機(jī)制是NH3/H+共運(yùn)[22-23]；菜用大豆的PvAMT1.1運(yùn)輸機(jī)制是NH4+/H+同向運(yùn)輸[24]；擬南芥AtAMT2的運(yùn)輸機(jī)制是NH3運(yùn)輸[25]。本研究解析出AtAMT1.3的運(yùn)輸機(jī)制是NH4+單向運(yùn)輸，理由如下：（1）酵母功能互補(bǔ)證領(lǐng)略AtAMT1.3具有吸銨功能[5]，電生理記錄得到了NH4+產(chǎn)生的電流（圖3），說(shuō)明進(jìn)入蛙卵的銨形態(tài)是離子態(tài)的（因分子進(jìn)入不會(huì)產(chǎn)生電流），擯棄了NH3運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制。（2）AtAMT1.3介導(dǎo)的銨內(nèi)流不受pH值調(diào)控（圖8），擯棄了NH4+/H+同向運(yùn)輸和NH3/H+共運(yùn)2種可能，由于假設(shè)是這2種機(jī)制的話(huà)，外界pH值變更（pH值由5.4轉(zhuǎn)變到74）使得溶液中H+的濃度減小100倍，即其中的一個(gè)底物量急劇裁減，勢(shì)必會(huì)對(duì)其運(yùn)輸產(chǎn)生巨大的影響。事實(shí)上，AtAMT1.3介導(dǎo)的銨內(nèi)流不受外界pH影響（圖8），那么AtAMT1.3的銨運(yùn)輸機(jī)理只可能是NH4+單向運(yùn)輸。（3）吸收動(dòng)力學(xué)擬合得到AtAMT1.3的希爾吸收等于1，說(shuō)明只有1種底物（圖6）。通過(guò)擬合Km值對(duì)電壓的憑借性，得到這個(gè)底物的結(jié)合位點(diǎn)位于整個(gè)膜電場(chǎng)52%的位置；進(jìn)一步說(shuō)明AtAMT1.3的運(yùn)輸機(jī)制是NH4+單向運(yùn)輸。AtAMT1.3運(yùn)輸機(jī)制與AtAMT1.1一致，而與AtAMT1.2不同；在同源性上前兩者之間也比AtAMT1.3與AtAMT1.2之間近（圖4）。由此揣測(cè)，抉擇AtAMT1.3與AtAMT1.2運(yùn)輸機(jī)制不同的很可能是與AtAMT1.1一致、而與AtAMT1.2差異較大的氨基酸區(qū)域，這個(gè)揣摩需要進(jìn)一步的試驗(yàn)表明。

擬南芥中AtAMT1.3缺失突變體引起的側(cè)根分化差異表型，只能由AtAMT1.3補(bǔ)回，而不能由AtAMT1.1補(bǔ)回[26]。AtAMT1.3在根本功能特征上與AtAMT1.