生物技術(shù)制藥第四章抗體制藥

生物技術(shù)制藥第四章抗體制藥第一頁，共四十五頁，2022年，8月28日第四章抗體制藥第一節(jié)概述第二節(jié)單克隆抗體第三節(jié)鼠源性單克隆抗體的改造第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程第五節(jié)抗體診斷試劑第六節(jié)抗體治療藥物第二頁，共四十五頁，2022年，8月28日第一節(jié)概述1890年：Behring和北里柴三郎等發(fā)現(xiàn)了白喉抗毒素，并建立了血清療法，開抗體制藥之先河。1937年：Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種（）球蛋白、乙種（）球蛋白和丙種（）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。20世紀(jì)60年代初期：抗原決定簇，精制單價(jià)血清。1975年：K?hler和Milstein等，單克隆抗體，其具有高度特異性、均一性，以及來源穩(wěn)定可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)。1984年：人-鼠嵌合抗體1984年至今：單克隆抗體的鼠源性及分子過大的問題得以解決，可僅作為與抗原特異性結(jié)合試劑。第三頁，共四十五頁，2022年，8月28日單克隆抗體的應(yīng)用用于疾病的診斷和治療：如利用單克隆抗體檢測與某些疾病相關(guān)的抗原，輔助臨床診斷，或用放射性核素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像，進(jìn)行免疫鑒定。用于臨床治療，如針對T淋巴細(xì)胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體，用作免疫抑制劑。單克隆抗體還可作為載體制備導(dǎo)向藥物。但是要解決以下兩個(gè)問題：（1）鼠源性單克隆抗體的免疫原性；（2）完整的抗體分子分子量過大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度。第四頁，共四十五頁，2022年，8月28日單克隆抗體的應(yīng)用基因工程技術(shù)為解決這兩個(gè)問題提供了可能。已通過基因工程技術(shù)，制備出改形抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等很多類型的抗體或抗體單位。基本消除了單克隆抗體的鼠源性，相對分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1/80~1/3，而且鼠源性單克隆抗體的生物學(xué)活性如激活補(bǔ)體、促進(jìn)吞噬功能（免疫調(diào)理）、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等，只保留同抗原特異性結(jié)合的活性。第五頁，共四十五頁，2022年，8月28日第二節(jié)單克隆抗體單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而生產(chǎn)的。由于這種抗體是針對一個(gè)抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，因此稱為單克隆抗體。它是結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體。制備的一般流程見下圖。第六頁，共四十五頁，2022年，8月28日單克隆抗體和

多克隆抗體的制備抗原脾B淋巴細(xì)胞融合融合淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞克隆1克隆2克隆3克隆4第七頁，共四十五頁，2022年，8月28日第二節(jié)單克隆抗體一、抗原與動(dòng)物免疫二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)三、篩選陽性克隆與克隆化四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定五、單克隆抗體的大量制備六、單克隆抗體的純化第八頁，共四十五頁，2022年，8月28日一、抗原與動(dòng)物免疫（1）制備用于動(dòng)物免疫的適當(dāng)抗原?；瘜W(xué)合成抗原，如精制的地高辛。多數(shù)情況下抗原物質(zhì)只能得到部分純化，甚至是極不純的混合物，如部分純化的干擾素。通過克隆化選出最適當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w。在制備惡性腫瘤細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體時(shí)，情況較復(fù)雜，需用整個(gè)腫瘤細(xì)胞做為免疫原，經(jīng)過篩選、克隆化，制備出僅存在于腫瘤細(xì)胞而不存在于正常細(xì)胞上的表面標(biāo)志分子上的單克隆抗體。第九頁，共四十五頁，2022年，8月28日一、抗原與動(dòng)物免疫（2）穩(wěn)定的雜交瘤的獲得因免疫動(dòng)物品系和骨髓瘤細(xì)胞在種系發(fā)生上距離越遠(yuǎn)，產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定，故一般采用與骨髓瘤供體同一品系的動(dòng)物進(jìn)行免疫。目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來自BALB/c小鼠和Lou大鼠，因此免疫動(dòng)物也多采用相應(yīng)的品系，最常用的也是BALB/c小鼠。選擇動(dòng)物時(shí)應(yīng)考慮到動(dòng)物品系的免疫應(yīng)答基因（Ir）對抗原免疫應(yīng)答的影響。不同品系的小鼠與大鼠在對某類抗原的免疫應(yīng)答上是不同的。書中表4-1是骨髓瘤細(xì)胞系一覽表，可以參考。第十頁，共四十五頁，2022年，8月28日一、抗原與動(dòng)物免疫（3）免疫方法：體內(nèi)免疫法和體外免疫法體內(nèi)免疫法：適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多時(shí)應(yīng)用，一般用8~12周齡的雌性鼠。顆粒性抗原（如細(xì)菌、細(xì)胞抗原）的免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔107個(gè)細(xì)胞進(jìn)行初次免疫，間隔1~3周，再追加免疫1~2次，可溶性抗原則按每只小鼠10~100g抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行初次免疫，間隔2~4周，再用不加佐劑的原抗原追加免疫1~2次。一般在采集脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原，其目的是使對應(yīng)的B淋巴細(xì)胞克隆受到可靠的最大限度的刺激，使其迅速地增殖分裂，因?yàn)榧?xì)胞融合后增殖最好的細(xì)胞是迅速分裂的細(xì)胞。有人認(rèn)為在常規(guī)免疫的基礎(chǔ)上用脾內(nèi)免疫法做追加免疫較佳。第十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日一、抗原與動(dòng)物免疫（3）免疫方法：體內(nèi)免疫法和體外免疫法體外免疫法：用于不能采用體內(nèi)免疫法的情況下，如制備人源性單克隆抗體，或者抗原的免疫原性極弱且能引起免疫抑制時(shí)使用。體外免疫法所需要的抗原量少，一般只需幾個(gè)g，免疫期短，僅4~5天，干擾因素少，已成功制備出針對多種抗原的單克隆抗體，但融合后產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞株不夠穩(wěn)定。其基本方法是用4~8周齡BALB/c小鼠的脾臟制成單個(gè)細(xì)胞懸液，再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá)0.5~5g/ml，在5%CO2、37℃下培養(yǎng)4~5天，再分離脾臟細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合。第十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)（1）細(xì)胞融合基本方法：取適量脾細(xì)胞（1×108）與骨髓瘤細(xì)胞（2×107~3×107）進(jìn)行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，時(shí)間控制在2min以內(nèi)，然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。（2）用于融合的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備條件：融合率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長期穩(wěn)定等特點(diǎn)。書中表4-1列舉了主要的骨髓瘤細(xì)胞系，其中SP2/0、P3.653細(xì)胞本身不分泌抗體，細(xì)胞融合后產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞只分泌均一的、完全來自脾細(xì)胞的抗體分子，它們是目前較為理想的可供融合的骨髓瘤細(xì)胞。特別是SP2/0細(xì)胞系還具有容易培養(yǎng)、融合率高等特點(diǎn)，被國內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室廣泛采用。第十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)（3）誘導(dǎo)劑PEG的影響：PEG分子量以及濃度越大，促融率越高。但其粘度和對細(xì)胞的毒性也隨之增大。目前常用的PEG的濃度為40%~50%，相對分子質(zhì)量以4000為佳。但相對分子量400~6000，濃度在10%~50%范圍之間的PEG都能使細(xì)胞融合。為了提高融合率，在PEG溶液中加入二甲基亞砜(DMSO），以提高細(xì)胞接觸的緊密性，增加融合率。但是，PEG和DMSO都對細(xì)胞有毒性，必須嚴(yán)格限制它們和細(xì)胞的接觸時(shí)間，可通過低速離心5min使細(xì)胞接觸更為緊密，然后用新配制的培養(yǎng)液來稀釋藥物并洗滌細(xì)胞。第十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)（4）培養(yǎng)基的正確選擇：常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基喋呤（A）能阻斷DNA合成的主要途徑，瘤-瘤融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞在這樣的條件下，幾天內(nèi)亦迅速死亡。由于SP2/0等骨髓瘤細(xì)胞都是次黃嘌呤（H）鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT）缺乏株，脾細(xì)胞中卻有這種酶，因此脾-瘤融合的雜交瘤細(xì)胞可利用HGPRT酶，用次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）合成DNA，使雜交瘤細(xì)胞得以生長第十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)（5）選擇性培養(yǎng)方法：通常將融合的細(xì)胞懸浮于HAT的培養(yǎng)液（配方見書中表4-2），加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)，根據(jù)情況每2~3天換液一次。換液時(shí)吸去1/2~2/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液。在融合后7天內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，殺死瘤-瘤融合細(xì)胞后，第7~14天改用HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的RPMI1640 完全培養(yǎng)液（配方書中表4-3），從融合后8~9天就可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測，篩選出產(chǎn)生抗體的陽性克隆。第十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)（6）飼養(yǎng)細(xì)胞：由于在最適的條件下大約有105個(gè)脾細(xì)胞才能形成一個(gè)雜交瘤細(xì)胞，大量瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中相繼死亡，單個(gè)或少數(shù)的雜交瘤細(xì)胞多半不能存活，所以通常要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等。一般認(rèn)為飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還能清除死亡細(xì)胞，故應(yīng)用的較多。第十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日三、篩選陽性克隆與克隆化（1）篩選陽性克?。阂?yàn)楫a(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細(xì)胞只占所有脾細(xì)胞的5%左右，所以要進(jìn)行每孔培養(yǎng)上清的抗體活性的篩選工作，以選擇出陽性克隆，然后進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。為了盡快地篩選出陽性克隆，必須采用微量、快速、特異、敏感、簡便并一次能檢測大批標(biāo)本的方法。常用的檢測方法有免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和放射免疫技術(shù)等。一般來說，免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)均適用于可溶性抗原及顆粒性抗原的抗體檢測。免疫熒光技術(shù)適用于細(xì)胞抗原的抗體檢測，特別是制備以檢測患者活檢組織標(biāo)本為目的的抗體時(shí)，免疫熒光法更有意義，在篩選抗體的同時(shí)，還能對所識別的抗原進(jìn)行定位判定。第十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日1、精制破傷風(fēng)毒素抗原（）吸附（約10g/ml，4℃，3h）洗滌2、加雜交瘤培養(yǎng)上清液（）（4℃，1h）3、加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體（）（4℃，1h）洗滌洗滌4、加酶作用底物，呈色孔為陽性克隆孔ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選第十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日三、篩選陽性克隆與克隆化（2）克隆化——有限稀釋法和軟瓊脂法篩選出來的陽性克隆中，可能含有不分泌抗體的細(xì)胞或有多株分泌抗體的細(xì)胞，而且剛剛?cè)诤汐@得的雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，染色體容易丟失，因此應(yīng)盡早克隆化。一般融合后獲得的雜交瘤細(xì)胞要經(jīng)過大約3次的克隆化，才能達(dá)到100%孔內(nèi)均為抗體陽性細(xì)胞克隆。常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。有限稀釋法是把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每個(gè)孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。第一次克隆化時(shí)也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。由于單個(gè)細(xì)胞難以存活，克隆化時(shí)也需加入飼養(yǎng)細(xì)胞輔助其生長。第二十頁，共四十五頁，2022年，8月28日三、篩選陽性克隆與克隆化（2）克隆化——有限稀釋法和軟瓊脂法軟瓊脂法是在培養(yǎng)液中加入0.5%左右的瓊脂糖凝膠，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細(xì)吸管將小球吸出，團(tuán)塊打碎后，移入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。用這種方法可以吸出大量克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，因初代細(xì)胞很不易增殖，所以用軟瓊脂法進(jìn)行克隆化容易成功。第二十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定（1）雜交瘤細(xì)胞的鑒定正常鼠的脾細(xì)胞染色體數(shù)為40，全部是端著絲粒染色體。小鼠骨髓瘤細(xì)胞的染色體數(shù)變異較大，SP2/0細(xì)胞為62~68，NS-1細(xì)胞為54~64，大多數(shù)為非整倍性，并且有中部著絲點(diǎn)染色體和亞中部著絲點(diǎn)染色體。雜交瘤細(xì)胞的染色體在數(shù)目上接近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上除多數(shù)為端著絲粒染色體外，還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標(biāo)志染色體。染色體數(shù)目較多又比較集中的雜交瘤細(xì)胞能穩(wěn)定分泌高效價(jià)的抗體，而染色體數(shù)目少且比較分散的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力較低。第二十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定（2）抗體性狀的鑒定由于不同類和不同亞類的免疫球蛋白生物學(xué)特性差異較大，諸如補(bǔ)體活化、免疫調(diào)理、ADCC效應(yīng)等等，因此要對制備的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體，進(jìn)行Ig類和亞類的鑒定，可用羊或兔抗Ig不同類和亞類的抗體，進(jìn)行免疫擴(kuò)散或ELISA法來鑒定。在單克隆抗體鑒定中還必須進(jìn)行親和力測定，它可為正確選擇不同用途的單克隆抗體提供依據(jù)。另外根據(jù)需要不同，還應(yīng)對單克隆抗體的特異性、純度和識別抗原的相對分子量等進(jìn)行測定。第二十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日五、單克隆抗體的大量制備（1）體外培養(yǎng)法可獲得10g/ml的抗體；（2）動(dòng)物體內(nèi)誘生法，可獲得5~20mg/ml的抗體。目前多采用后者生產(chǎn)制備單克隆抗體。因?yàn)殡s交瘤細(xì)胞的兩種親本細(xì)胞均來自BALB/c小鼠，所以應(yīng)選用BALB/c小鼠來制備單克隆抗體。為了使雜交瘤細(xì)胞在腹腔內(nèi)增殖良好，可于注入細(xì)胞的幾周前，預(yù)先將具有刺激性的有機(jī)溶劑降植烷（pristane）注入腹腔內(nèi)，以破壞腹腔內(nèi)膜，建立雜交瘤易于增殖的環(huán)境。動(dòng)物體內(nèi)誘生法操作簡便，也比較經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體量較多且效價(jià)亦高，還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細(xì)胞株，缺點(diǎn)是小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。第二十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日五、單克隆抗體的大量制備書中介紹了體外培養(yǎng)法和動(dòng)物體內(nèi)誘生法的具體步驟以及其它一些近來發(fā)展的方法。這里不一一介紹。利用懸浮培養(yǎng)方式可增加細(xì)胞生長空間，雜交瘤細(xì)胞生長旺盛，單克隆抗體產(chǎn)量得到提高。連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度可達(dá)2.0107細(xì)胞/ml，收集的單克隆抗體可達(dá)到400g/ml左右。如在培養(yǎng)液中加入固體顆粒作為細(xì)胞生長的載體，增大單位體積的表面積，利于雜交瘤細(xì)胞生長，細(xì)胞密度可達(dá)108細(xì)胞/ml。并能收獲更多的單抗。此稱為微載體懸浮培養(yǎng)法，固體顆粒用DEAE-SephadexA50等材料制成。第二十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日六、單克隆抗體的純化動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體具體方法及過程1、澄清和沉淀處理小鼠腹水中含有紅細(xì)胞、細(xì)胞碎塊、纖維蛋白凝塊及脂質(zhì)等，應(yīng)首先用離心力1000g離心5min，去除殘留的小顆粒物質(zhì)；再用0.2m的微孔濾膜過濾，除掉污染的細(xì)菌、支原體和脂質(zhì)；用飽和硫酸銨沉淀抗體，50%飽和硫酸銨能回收90%以上的單克隆抗體。2、分離根據(jù)用途可選用不同的方法，主要分離方法有凝膠過濾、陰離子交換層析、親和層析等。第二十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日六、單克隆抗體的純化2、分離（1）凝膠過濾用于IgG和IgM類單克隆抗體的分離純化。常用SephadexG200作分離介質(zhì)，可收集到三個(gè)峰，最高峰為IgM，另兩個(gè)峰為IgG，抗體回收率達(dá)50%~80%，能去除污染的微量雜蛋白，抗體純度可達(dá)95%以上。（2）陰離子交換層析用于IgG類單克隆抗體的分離純化。在pH7.4條件下，IgG1和IgG2能結(jié)合在DEAE填料上，其中IgG2a可在較低離子強(qiáng)度條件下洗脫下來，其純度較高。IgG2b、IgG3在低離子強(qiáng)度下易發(fā)生沉淀，可增加離子強(qiáng)度以提高產(chǎn)量，但其純度相對較低。在pH5.5條件下，把雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液加到瓊脂糖柱上時(shí)，所有的抗體都能結(jié)合到柱上，而55%的雜蛋白可被洗脫掉，再用不同離子強(qiáng)度的洗脫劑洗下。第二十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日續(xù)（2）離子交換法在最適離子強(qiáng)度及pH條件下，以離子交換層析分離單克隆抗體可以純化25~100倍。高容量、高流速、化學(xué)穩(wěn)定的新型離子交換劑適宜單克隆抗體的大規(guī)模純化。（3）親和層析多用蛋白A親和層析，適用于IgG類單克隆抗體的純化。IgG與蛋白A的結(jié)合與pH有密切關(guān)系，鼠源性單克隆抗體在pH8.0時(shí)，IgG2b、IgG3幾乎全部結(jié)合于蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5緩沖液可洗脫IgG2b，pH4.0緩沖液可洗脫下IgG3，pH4.5緩沖液可洗脫下IgG2a，pH6.0可洗脫下IgG1。用蛋白A親和層析收獲的抗體純度很高，但也有極微量的雜蛋白。第二十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日第三節(jié)鼠源性單克隆抗體的改進(jìn)改造鼠源性單克隆抗體的目的：一是降低免疫原性；二是降低相對分子量，增加組織通透性。如將鼠源性單克隆抗體的C區(qū)用人的Ig分子的C區(qū)置換，則對人的免疫原性消失。對鼠源性抗體的改造已有很多成果報(bào)道，見書中表4-4，給出了改造后的單抗的類型和特性：有人-鼠嵌合抗體（人IgC-小鼠IgV，150000）、改形抗體（將小鼠CDRs替換為人CDRs，150000）、Fab(完整L鏈和Fd，50000）、FV（VH和VL，25000）、單鏈抗體（SCFV，VH-多肽-VL，27000）、單域抗體（VH或VL，12500）、最小識別單位（MRU）（一個(gè)CDR，<2000）。第二十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日一、人-鼠嵌合抗體制備方法：提取雜交瘤細(xì)胞系的mRNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板，采用特異引物，用PCR方法分別擴(kuò)增VL和VH基因，再分別連接真核表達(dá)所需的上游啟動(dòng)子、前導(dǎo)肽序列和下游剪切供體信號、增強(qiáng)子真核調(diào)控序列后，將VL基因克隆到人Ig的CL基因表達(dá)載體上，將VH基因克隆到人IgG1的C基因真核表達(dá)載體上，再將人-鼠嵌合的V-C區(qū)基因質(zhì)粒DNA等量混合，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，轉(zhuǎn)染后用含霉酚酸進(jìn)行篩選，形成集落的細(xì)胞即為共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所分泌的抗體為嵌合抗體。它保持鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合的特異性，但對人的免疫原性大幅下降了。如若用人IgG1或IgG3的C基因替換鼠IgG1或IgG2b，則可有效地加強(qiáng)多肽的ADCC效應(yīng)與免疫調(diào)理作用。第三十頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、改形抗體Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR區(qū)），而不是整個(gè)可變區(qū)。H和L鏈各有三個(gè)CDR，其他部分稱為框架區(qū)。如果用鼠源性單克隆抗體的CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性?？贵w分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。這種改形抗體（reshapingantibody）又稱CDR移植抗體（CDRgraftingantibody）。書中表4-5給出幾種改形抗體及其潛在的臨床應(yīng)用。第三十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日三、小分子抗體基因工程小分子抗體僅表達(dá)鼠源性單克隆抗體的V區(qū)片段，其相對分子量僅為原抗體的1/80~1/3。也就是說，保留了CDR區(qū)，而Ig分子的C區(qū)不表達(dá)?，F(xiàn)在研制的小分子抗體有以下幾種類型：（1）Fab抗體，由完整的輕鏈和重鏈（VH和CH1）所組成。（2）FV抗體，由VH和VL組成，天然FV片段中VH和VL為非共價(jià)性結(jié)合。（3）單鏈抗體（singlechainantibodySCA或singlechainFV,SCFV），由VH和VL通過一段連接肽（linker）連接而成的重組蛋白。有分子量小、穿透力強(qiáng)、免疫原性小特點(diǎn)，可與效應(yīng)分子相連接構(gòu)建新功能抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體的理想元件。（4）單域抗體，由VH(VL)單個(gè)可變區(qū)組成的，只有抗體分子的1/12，而且表面疏水性強(qiáng)，與抗原非特異結(jié)合能力也強(qiáng)。（5）最小識別單位（MRU）是由單個(gè)CDR區(qū)構(gòu)成的小分子抗體，親和力較低。第三十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日四、雙功能抗體雙功能抗體就是雙特異性抗體（biospecificantibody,BsAb）。它是一種非天然性的抗體，其結(jié)合抗原的兩個(gè)臂具有不同的特異性。1、化學(xué)交聯(lián)法2、生物學(xué)方法（雜種-雜交瘤）雜交瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞融合得到可分泌兩種親代抗體和雜種抗體的雜種-雜交瘤細(xì)胞。3、基因工程方法采用適當(dāng)?shù)慕宇^連接不同抗體的VH和VL區(qū)，使它們不能形成鏈內(nèi)的分子內(nèi)配對，讓其形成原抗體的分子內(nèi)配對，構(gòu)建雙特異性（SCFV)2。第三十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日五、抗體融合蛋白類型有：（1）配基-配基型融合蛋白，如CD4-Fc。（2）配基-Ig嵌合型蛋白，如IL-2-Ig。（3）配基-FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3。（40受體-FV型融合蛋白。（5）酶-抗體型融合蛋白。其中較為成熟的是配基-Ig型嵌合蛋白，而酶-抗體型融合蛋白（即抗體酶，abeneyme）在藥物治療中應(yīng)用前景廣闊，它可在靶向位置上將前體藥物轉(zhuǎn)化成有效的藥物，避免對正常組織的傷害，此法稱為抗體介導(dǎo)的酶前體藥物治療。第三十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日五、抗體融合蛋白構(gòu)建抗體融合蛋白的原則是：將第一個(gè)蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個(gè)蛋白基因，即可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因共表達(dá)。在抗體的N端和C端融合其它蛋白都可以獲得成功。關(guān)鍵是兩個(gè)蛋白間的接頭序列l(wèi)inker，一般說來3~5個(gè)氨基酸就可滿足大部分融合蛋白的正確折疊的要求。如加入一段有疏水性和一定伸展性的長鏈，可緩解兩種蛋白的相互干擾。第三十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程一、噬菌體抗體庫技術(shù)的基本方法1、獲得目的基因2、抗體庫技術(shù)的載體：現(xiàn)在普遍使用噬菌粒（phagemid）載體，其中的pHEN1為新一代載體，轉(zhuǎn)化效率高，有利于提高庫容量。3、淘篩：抗原固定化后，對噬菌粒群的吸附、洗滌和洗脫后再感染擴(kuò)增，與輔助噬菌體超感染獲得大容量次級文庫，再反復(fù)與抗原吸附，經(jīng)幾輪淘篩后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量擴(kuò)增。四、表達(dá)與鑒定：目的克隆經(jīng)過鑒定后，再導(dǎo)入感受態(tài)菌株，進(jìn)行可溶性表達(dá)，其產(chǎn)物用westernblot分析確定后，就完成了全過程。第三十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、噬菌體抗體庫技術(shù)的特點(diǎn)1、模擬天然全套抗體庫抗體文庫1011庫容，能包含B細(xì)胞全部克隆。建庫的外源基因來自人外周血、骨髓或脾臟的淋巴細(xì)胞提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA擴(kuò)增，使用的通用引物采自多個(gè)人體，具有人的種屬普遍性。VH和VL隨機(jī)重組增加抗體的多樣性。2、避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)3、可獲得高親和力的人源化抗體在噬菌體抗體庫中，VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟過程，所用抗體基因又都是來自人體，因此產(chǎn)生的抗體必然