生物素親和素

生物素親和素第一頁，共六十頁，2022年，8月28日概述生物素－親合素系統(tǒng)（Biotin-Avidin—System，BAS）是70年代末發(fā)展起來的一種以生物素和親合素的特異結(jié)合反應(yīng)為原理的新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)各領(lǐng)域之中。1979年Guesdon利用生物素和親合素間具有高度親合力的特點(diǎn)，建立了標(biāo)記親合素和生物素法與橋聯(lián)親合素—生物素技術(shù)。1981年Hsu首次報(bào)告了改進(jìn)的親合素—生物素—過氧化酶復(fù)合物法（ABC法）。近年大量研究證實(shí)，生物素—親合素系統(tǒng)幾乎可與目前研究成功的各種標(biāo)記物結(jié)合，如酶、熒光素、同位素、凝集素、鐵蛋白、核酸等。生物素—親合素已成為目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術(shù)。第二頁，共六十頁，2022年，8月28日一)生物素二)活化生物素與標(biāo)記三)親和素及鏈霉親和素四)親和素及鏈霉親和素的標(biāo)記五)生物素-親和素系統(tǒng)六)生物素-親和素系統(tǒng)的應(yīng)用第三頁，共六十頁，2022年，8月28日第一部分

生物素第四頁，共六十頁，2022年，8月28日功能：可與多種標(biāo)記物如酶、熒光素、同位素、凝集素、鐵蛋白、核酸等結(jié)合。這些生物活性物質(zhì)在生物素化后，其活性不會(huì)受到顯著影響。如抗體分子經(jīng)生物素化后，其結(jié)合抗原的活性不受影響。同樣多種酶結(jié)生物素化，其催化力也保持不變或稍有降低。概念：生物素(biotin)是動(dòng)、植物體內(nèi)廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶R或維生素H。生物素第五頁，共六十頁，2022年，8月28日與親合素結(jié)合與抗體或酶結(jié)合分子式：C10H16O3N2S

分子量：244.31等電點(diǎn)：PH=3.5溶解特性：難溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)：

I環(huán)（咪唑酮環(huán)）為與親和素結(jié)合的主要部位；

II環(huán)（噻吩環(huán)）為結(jié)合抗體和其它生物大分子的部位，C2上戊酸側(cè)鏈的未端羧基是結(jié)合生物大分子的唯一結(jié)構(gòu)生物素第六頁，共六十頁，2022年，8月28日結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：咪唑酮環(huán)/四氫噻吩環(huán)結(jié)合親和素側(cè)鏈末端羧基結(jié)合蛋白質(zhì)特性：羧基需經(jīng)活化修飾才能結(jié)合蛋白質(zhì)（羧基活化的生物素稱活化生物素或生物素衍生物）I咪唑酮環(huán)

Ⅱ噻吩環(huán)

羧基生物素第七頁，共六十頁，2022年，8月28日生物素的特點(diǎn)：1）生物素分子較小，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，由于大分子蛋白質(zhì)的空間位阻效應(yīng)，可影響生物素與親和素間的結(jié)合；2）生物素只能依靠肽鍵與蛋白質(zhì)上的氨基結(jié)合。

活化生物素可克服以上缺點(diǎn)，既減少空間位阻效應(yīng)，又可擴(kuò)大其結(jié)合的對象。生物素第八頁，共六十頁，2022年，8月28日第二部分

活化生物素與標(biāo)記第九頁，共六十頁，2022年，8月28日生物素側(cè)鏈的末端羧基經(jīng)化學(xué)修飾后制成帶各種活性基團(tuán)的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)活化生物素第十頁，共六十頁，2022年，8月28日活化生物素易與抗原、抗體酶及核酸分子中相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)形成生物素化標(biāo)記物標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）長臂活化生物素（BCNHS）

標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素3-（N-馬來酰亞胺-丙酰）-生物胞素（MPB）標(biāo)記核酸的活化生物素光生物素、BNHS和BHZ生物素脫氧核苷三磷酸活化生物素第十一頁，共六十頁，2022年，8月28日適合于Ab、酶、中性或偏堿性Ag、DNA、蛋白的標(biāo)記標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素第十二頁，共六十頁，2022年，8月28日標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素長臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個(gè)6-氨基已糖分子基團(tuán)，形成連結(jié)臂，生物素與大分子基團(tuán)的距離增加，更易發(fā)揮生物素的活性作用。如何減小空間位阻生物素分子量小，當(dāng)與抗體或酶形成生物素標(biāo)記結(jié)合物后，由于大分子蛋白的空間位阻效應(yīng)，可對生物素與親和素的結(jié)合以及BAS的應(yīng)用效果造成干擾。如何減小空間位阻？第十三頁，共六十頁，2022年，8月28日標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素標(biāo)記特點(diǎn)：BNHS和BCNGS中的羧基與蛋白質(zhì)中的賴氨酸氨基結(jié)合達(dá)到標(biāo)記的目的BNHS分子可與蛋白質(zhì)賴氨酸的氨基形成肽鍵BNHS適用標(biāo)記抗體和中性或偏堿性的蛋白質(zhì)第十四頁，共六十頁，2022年，8月28日標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼與生物素的合成物主要用于標(biāo)記偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)

：生物素與賴氨酸連接后，再與無水肼反應(yīng)而成。除醛基外，BCHZ還可標(biāo)記氨基第十五頁，共六十頁，2022年，8月28日標(biāo)記特點(diǎn)：BHZ與蛋白質(zhì)中的醛基結(jié)合而標(biāo)記標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素第十六頁，共六十頁，2022年，8月28日標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素馬來酰亞胺-丙酰-生物胞素（MPB)：能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化生物素第十七頁，共六十頁，2022年，8月28日標(biāo)記核酸的活化生物素光生物素(photobiotin)光敏物質(zhì)側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團(tuán)，經(jīng)光照后，變?yōu)榉枷慊趸剑芍苯优c腺嘌呤氨基結(jié)合，形成B-核酸探針，用于DNA或RNA的標(biāo)記。目前常用光生物素和生物素化dUTP作為標(biāo)記核酸的活化生物素。N3NO2NH(CH2)3N(CH2)3CH3NHC(CH2)4SNHNHO第十八頁，共六十頁，2022年，8月28日生物素脫氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）

作為TTP的結(jié)構(gòu)類似物，可采用缺口移位法摻入到雙鏈DNA中。標(biāo)記核酸的活化生物素BNHS和BHZ

可直接標(biāo)記核酸，但對堿基配對有影響（影響氫鍵的形成）第十九頁，共六十頁，2022年，8月28日特性：活化生物素通過側(cè)鏈與蛋白分子連接；一個(gè)蛋白分子可被多個(gè)生物素標(biāo)記－多價(jià)性（是BAS多級放大作用的物質(zhì)基礎(chǔ)）；BNHS多標(biāo)記抗體和中性或偏堿性的蛋白質(zhì),BHZ則多標(biāo)記微酸性抗原；抗原、抗體標(biāo)記后活性不變；可對標(biāo)記材料（如酶）標(biāo)記：堿性磷酸酶標(biāo)記后，活性降低；活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)第二十頁，共六十頁，2022年，8月28日注意事項(xiàng)：選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標(biāo)記基團(tuán)的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；控制生物素：蛋白質(zhì)比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜為2:1，IgG應(yīng)用濃度0.5~5μg/ml；生物素1~3個(gè)/Ag，3~5個(gè)/Ab；使用交聯(lián)臂減少空間阻力活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)第二十一頁，共六十頁，2022年，8月28日第三部分

親和素和鏈霉親和素第二十二頁，共六十頁，2022年，8月28日親和素概念：是動(dòng)物微生物中提取的一種含10%碳水化物的堿性糖蛋白，可由蛋清中提取。親和素可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合，這雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。且由于多種生物活性物質(zhì)在生物素化后，其活性不會(huì)受到顯著影響，故而二者在結(jié)合反應(yīng)時(shí)具有的多級放大作用。主要包括：卵白親合素、鏈親合素、卵黃親合素及類親合素等。后兩種因其特異性親合力低，研究不多，前兩種目前已深入研究并得到廣泛應(yīng)用。結(jié)構(gòu)：4個(gè)相同亞基組成的四聚體糖蛋白，富含色氨酸，它是與生物素結(jié)合的基團(tuán)。特性：每個(gè)亞基都可結(jié)合1個(gè)生物素分子，即1個(gè)親和素分子可結(jié)合4個(gè)生物素分子。第二十三頁，共六十頁，2022年，8月28日分子量：68000親和常數(shù)：1015/mol缺點(diǎn)：由于是堿性蛋白（PI=10），且含糖基，與聚苯乙烯的非特異性吸附較高，會(huì)導(dǎo)致本底增大，降低檢測靈敏度。親和素溶于水：C=5mg/ml；比活性：A≥12u/mgP第二十四頁，共六十頁，2022年，8月28日概念：是從鏈球菌屬的菌培養(yǎng)液中提取的一種蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：為弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基，因此與聚苯乙稀的非特異性吸附遠(yuǎn)低于親和素，因此應(yīng)用廣泛。結(jié)構(gòu)：由4個(gè)相同的肽鏈組成，甘氨酸和丙氨酸含量較大。特性：1個(gè)親和素分子可結(jié)合4個(gè)生物素分子。鏈霉親和素分子量：65000親和常數(shù)：1015/mol第二十五頁，共六十頁，2022年，8月28日結(jié)構(gòu)

四亞基糖蛋白

四肽鏈蛋白無糖基PI10.5

6結(jié)合位色氨酸

色氨酸生物素

44Ka

10151015活性

13～15U15～18U親合素（AV）鏈霉親合素(SA)SA表面所帶正電荷少，且不含糖基，非特異性結(jié)合遠(yuǎn)低于AV，因此目前以SA標(biāo)記的酶結(jié)合物更為常用。親和素和鏈霉親和素第二十六頁，共六十頁，2022年，8月28日親合素(Avidin,AV)親和素（Avidin)耐熱并耐受多種蛋白水解酶的作用，與生物素結(jié)合后穩(wěn)定性更好。每個(gè)親和素能結(jié)合四個(gè)分子的生物素生物素（Biotin,B）第二十七頁，共六十頁，2022年，8月28日第二十八頁，共六十頁，2022年，8月28日第四部分

親和素和鏈霉親和素的標(biāo)記第二十九頁，共六十頁，2022年，8月28日親和素的標(biāo)記：HRP(過氧化酶)的標(biāo)記標(biāo)記物：小分子物質(zhì)：示蹤物125I、膠體金、異硫氰酸熒光素(FITC)、化學(xué)發(fā)光物大分子物質(zhì)：如酶、抗原、抗體、鐵蛋白

親和素和鏈霉親和素的標(biāo)記改良過碘酸鈉法戊二醛法鏈霉親和素的標(biāo)記方法：過碘酸鈉法HRP+NaIO4+SA透析+KBH4

沉淀第三十頁，共六十頁，2022年，8月28日親和素標(biāo)記-過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4+NH2AvidinOOOHOHNAvidinH2OOOOHOOONAvidinNAvdinNaBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)第三十一頁，共六十頁，2022年，8月28日親和素標(biāo)記-戊二醛法酶－NH2親和素－NH2＋(CH2)3CHOCHO(CH2)3CHN酶CHN親和素第三十二頁，共六十頁，2022年，8月28日鏈霉親和素標(biāo)記-過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOH+NH2SAvidinNSAvidinH2OOOOHOOONSAvidinNAvdinKBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)第三十三頁，共六十頁，2022年，8月28日第五部分

生物素-親合素系統(tǒng)第三十四頁，共六十頁，2022年，8月28日生物素-親合素系統(tǒng)生物素與親合素之間結(jié)合的親合力高、特異性強(qiáng)生物素與親合素各自均可以與各型大小分子結(jié)合，以及二者在結(jié)合反應(yīng)時(shí)具有的多級放大作用等優(yōu)越性使BAS及其相關(guān)技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標(biāo)記免疫檢測自動(dòng)化分析做出了極大的貢獻(xiàn)

第三十五頁，共六十頁，2022年，8月28日靈敏度高:生物素標(biāo)記蛋白具有多價(jià)性，且標(biāo)記后的抗原/抗體生物活性不變，每個(gè)親合素有四個(gè)生物素結(jié)合部位，可同時(shí)以多價(jià)形式結(jié)合到生物素化大分子衍生物和標(biāo)志物上，因此，BAS具有多級放大作用，反應(yīng)的靈敏度高。穩(wěn)定性高和特異性強(qiáng)：AV/SA與生物素結(jié)合的親和常數(shù)比抗原-抗體反應(yīng)至少高1萬倍，二者的結(jié)合呈高度專一性和不可逆性，且酸、堿、變性劑、蛋白溶解酶、有機(jī)溶劑以及反應(yīng)試劑的高度稀釋均不影響其結(jié)合。因此，BAS穩(wěn)定性高，特異性強(qiáng)。生物素-親合素系統(tǒng)(BAS)的特點(diǎn)第三十六頁，共六十頁，2022年，8月28日適用性廣泛：BAS的多級放大作用，以及既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標(biāo)記材料，使BAS不僅用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可制成親和介質(zhì)用于上述各類反應(yīng)體系中反應(yīng)物的分離、純化。其他：可制成通用試劑（如生物素化二抗等）；反應(yīng)試劑可高度稀釋，特別是與一抗偶聯(lián)使用可大幅減少一抗用量，降低實(shí)驗(yàn)成本；實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間不長。生物素-親合素系統(tǒng)(BAS)的特點(diǎn)第三十七頁，共六十頁，2022年，8月28日BAS的基本類型及原理

可有Ag與Ab反應(yīng)的各種免疫方法：夾心法、間接法、競爭法等，在此基礎(chǔ)上引入A-B系統(tǒng)。BAB法：BA法：ABC法：第三十八頁，共六十頁，2022年，8月28日BAB法（親和素-標(biāo)記生物素法）：特點(diǎn)：以游離親和素為橋臂，分別連接生物素化抗原（或抗體）和標(biāo)記生物素（如酶標(biāo)生物素）

BAS的基本類型及原理-BAB法第三十九頁，共六十頁，2022年，8月28日Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E+A+A親和素-標(biāo)記生物素法（BAB法）：先使抗原與生物素（B）化的抗體結(jié)合，再以游離親合素(A)將生物素化的抗體與酶標(biāo)生物素搭橋連接，也達(dá)到多層放大效果。親合素(A)生物素化的抗體酶標(biāo)生物素底物BAS的基本類型及原理-BAB法第四十頁，共六十頁，2022年，8月28日BAS的基本類型及原理-BA法BA法（標(biāo)記親和素-生物素法）特點(diǎn)：以標(biāo)記親和素/標(biāo)記鏈霉親和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的游離親和素（A），省卻了加標(biāo)記生物素（B-E）的步驟。第四十一頁，共六十頁，2022年，8月28日+A-E標(biāo)記親和素-生物素法（BA法）：以標(biāo)記親和素/標(biāo)記鏈霉親和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的親和素（A），省卻了加標(biāo)記生物素（B-E）的步驟。A-E+A-EBAS的基本類型及原理-BA法

Ag+B·AbAg-Ab·BA·E/SA·EAg-Ab·B-A/SA·E第四十二頁，共六十頁，2022年，8月28日BAS的基本類型及原理-ABC法ABC系統(tǒng)（親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物系統(tǒng)）特點(diǎn):將BAB法中的A（親和素）先與B-E（酶標(biāo)生物素）結(jié)合，制備成復(fù)合物ABC（親和素-生物素-過氧化酶復(fù)合物），網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，使該法的檢測靈敏。度顯著提高。ABC法⑴A+B·EA-B·E----ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC第四十三頁，共六十頁，2022年，8月28日（1）ABC復(fù)合物的制備：生物素生物素-PO過氧化物酶（PO）親和素親和素-生物素-POBAS的基本類型及原理-ABC法第四十四頁，共六十頁，2022年，8月28日ABC法中過氧化物酶常用辣根過氧化物酶，通過它與底物的顯色程度來判斷抗體或抗原含量并對其進(jìn)行標(biāo)記。此法廣泛應(yīng)用于免疫組織化學(xué)及酶聯(lián)免疫吸附等技術(shù)中生物素化的二抗一抗過氧化物酶底物顯色的反應(yīng)混合物固定化抗原生BAS的基本類型及原理-ABC法（2）ABC法反應(yīng)原理第四十五頁，共六十頁，2022年，8月28日+ABCAb-Ag-Ab-B

+

ABCAb-Ag-Ab-B-ABC預(yù)先按一定比例將親和素（或鏈霉親和素）與酶標(biāo)生物素結(jié)合，形成可溶性的親和素（或鏈霉親和素）-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC或SABC）。當(dāng)其與檢測反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時(shí)，ABC（或SABC）復(fù)合物中未飽和的親和素（或鏈霉親和素）結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，使抗原-抗體反應(yīng)體系與ABC（或SABC）標(biāo)記體系連成一體進(jìn)行檢測+BAS的基本類型及原理-ABC法第四十六頁，共六十頁，2022年，8月28日ABC法原理示意圖BAS的基本類型及原理-ABC法第四十七頁，共六十頁，2022年，8月28日BABBAABCBAS的分類比較BAB與ABC成員相同，反應(yīng)順序不同第四十八頁，共六十頁，2022年，8月28日此外，按待檢反應(yīng)體系中所用的是生物素化第一抗體或生物素化第二抗體，BAS分為直接法和間接法。

方法

反應(yīng)層次

直接法BAAg-(Ab-B)-A*BABAg-(Ab-B)-A-B*ABCAg-(Ab-B)-A-B*C

間接法BAAg-Ab1-(Ab2-B)-A*BABAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*ABCAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*CBAS實(shí)驗(yàn)方法及反應(yīng)層次BAS的分類比較第四十九頁，共六十頁，2022年，8月28日第六部分

生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用第五十頁，共六十頁，2022年，8月28日BAS在酶免疫技術(shù)中的應(yīng)用BAS在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用BAS在放射免疫技術(shù)中的應(yīng)用BAS在分子生物學(xué)中的應(yīng)用生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用第五十一頁，共六十頁，2022年，8月28日BAS在酶免疫技術(shù)中的應(yīng)用BAS在ELISA中的應(yīng)用：生物素-親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測定BAB-ELISA夾心法測抗原的原理：用生物素化的抗體替代常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)抗體，與已與固相抗體結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，然后連接親和素及酶標(biāo)生物素，從而使反應(yīng)信號放大，提高檢測靈敏度BAS在ELISA中的應(yīng)用：BAS用于固相化抗原/抗體的制備：AV/SA先包被固相載體、抗原/抗體先與生物素結(jié)合AV/SA-B反應(yīng)而使抗原/抗體固相化。BAS用于ELISA的終反應(yīng)放大：BA-ELISA、BAB-ELISA、ABC-ELISABAS在均相酶免疫測定中的應(yīng)用：

B·E*A-B·E（酶因活性中心受空間位阻作用而失活）反應(yīng)系統(tǒng)：B·E*

、Ag·A、Ab（限量）、標(biāo)準(zhǔn)Ag/待檢AgAg·A和待檢Ag競爭結(jié)合限量Ab，若AgAg·AbAg·AAg·A-B·E酶活性變化與待測標(biāo)本中抗原濃度呈負(fù)劑量相關(guān)。（酶活性降低）A第五十二頁，共六十頁，2022年，8月28日BAS在酶免疫技術(shù)中的應(yīng)用第五十三頁，共六十頁