外泌體治療支氣管肺發(fā)育不良的研究進(jìn)展(全文)

最新：外泌體治療支氣管肺發(fā)育不良的研究進(jìn)展（全文）摘要支氣管肺發(fā)育不良預(yù)后不良。干細(xì)胞治療可能是唯一可促進(jìn)受損肺修復(fù)重建的方法，其機制可能是其產(chǎn)生及分泌的外泌體。外泌體具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、抑制肺纖維化及促進(jìn)受損肺組織再生等功能，有望成為防治支氣管肺發(fā)育不良的新的切入點。本文就外泌體治療支氣管肺發(fā)育不良的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述?！娟P(guān)鍵詞】支氣管肺發(fā)育不良；外泌體；細(xì)胞和組織療法支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonarydysplasia，BPD）是由肺損傷和肺修復(fù)失衡造成的慢性肺部疾病。針對BPD可能的發(fā)病機制，給予相應(yīng)的治療措施，如避免早產(chǎn)［1］、產(chǎn)前使用糖皮質(zhì)激素［2］、保護(hù)性通氣策略［3］、確定最佳氧飽和度目標(biāo)范圍、使用外源性肺表面活性物質(zhì)經(jīng)氣道肺內(nèi)給藥等［4-5］，使得早產(chǎn)兒因呼吸衰竭的病死率降低，存活率增加。但存活的低出生體重兒、肺部發(fā)育還處于肺囊泡期/原始肺泡期的早產(chǎn)兒，以及因產(chǎn)前或生后因素導(dǎo)致正常肺泡、肺血管發(fā)育受阻的新生兒，肺部可出現(xiàn)以肺泡和肺微血管發(fā)育障礙為主的病理改變，主要表現(xiàn)為肺泡變大、結(jié)構(gòu)簡單化以及肺微血管減少、受損，導(dǎo)致肺動脈高壓［2，6］，目前稱為“新BPD”，其在胎齡28周以下嬰兒中發(fā)病率高達(dá)40%［7-8］。BPD發(fā)病機制復(fù)雜，是肺泡及肺血管在發(fā)育過程中受到諸多產(chǎn)前（如胎盤功能障礙、胎兒生長受限、絨毛膜羊膜炎、細(xì)菌定植、妊娠期高血壓疾病、孕期吸煙、服藥及遺傳易感性等）、生后（如呼吸機相關(guān)性肺損傷、氧療、感染及營養(yǎng)缺乏等）以及早產(chǎn)等多因素相互作用的結(jié)果［9-10］。目前針對BPD可能的發(fā)病機制提出的臨床治療措施雖然一定程度上提高了早產(chǎn)兒的存活率，但尚無法針對受損肺組織進(jìn)行后期修復(fù)再生。因此尋找促進(jìn)患肺后期修復(fù)并減少并發(fā)癥的治療方法就顯得尤為重要。近年來，隨著再生醫(yī)學(xué)及干細(xì)胞治療研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)外泌體可在不同細(xì)胞及組織之間進(jìn)行信息傳遞，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、抑制肺纖維化及促進(jìn)受損肺組織再生等功能，同時因其來源廣泛、結(jié)構(gòu)特殊和低免疫原性而備受廣大科研工作者的關(guān)注。故本文將目前外泌體在BPD發(fā)展過程中的作用進(jìn)行綜述，為后續(xù)進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。一、外泌體概述外泌體是由細(xì)胞分泌的具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的納米級囊泡狀物質(zhì)，直徑30～200nm，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸、核糖核酸、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)［11］。最初認(rèn)為外泌體是細(xì)胞排除廢物的一種機制，目前認(rèn)為外泌體的分泌是通過轉(zhuǎn)移細(xì)胞成分進(jìn)行細(xì)胞間通訊的有效方法［12-13］。外泌體來源廣、分布廣，可從血液、尿液、支氣管肺泡灌洗液和羊水等中提取，其生物學(xué)起源過程所涉及的具體機制目前仍不完全清楚，現(xiàn)有研究認(rèn)為不同類型細(xì)胞形成外泌體的過程大同小異——細(xì)胞早期通過內(nèi)吞作用形成小囊泡，小囊泡再融合形成早期核內(nèi)體，并逐漸發(fā)展為晚期核內(nèi)體，隨后胞質(zhì)內(nèi)微小RNA、酶分子、蛋白經(jīng)過復(fù)雜的分選機制進(jìn)入晚期核內(nèi)體，晚期核內(nèi)體會產(chǎn)生很多小囊泡，并逐漸演變成多泡體，最后這些小囊泡會被釋放到細(xì)胞外，形成外泌體［14］。外泌體的分泌可轉(zhuǎn)移細(xì)胞成分進(jìn)行細(xì)胞間通訊。目前有關(guān)外泌體與BPD的研究表明，外泌體可直接到達(dá)肺部微環(huán)境，并將攜帶的蛋白質(zhì)、核酸等生物活性物質(zhì)傳遞至受損肺組織細(xì)胞，通過影響炎癥因子的分泌、巨噬細(xì)胞的表型等在受損肺組織中發(fā)揮抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、促進(jìn)修復(fù)再生的作用［15］，其主要途徑（圖1）包括：（1）外泌體表面的膜蛋白通過識別靶細(xì)胞表面膜受體以激活靶細(xì)胞；（2）外泌體的胞外膜蛋白在蛋白酶的催化下形成的表面膜蛋白碎片可作為靶細(xì)胞表面受體的配體；（3）外泌體質(zhì)膜可與靶細(xì)胞膜融合，將蛋白質(zhì)、核糖核酸等內(nèi)容物釋放入靶細(xì)胞，完成信息傳遞；（4）外泌體通過胞吞形式被靶細(xì)胞完全攝入?？傊?，外泌體可運輸親本細(xì)胞的各種“生物活性物質(zhì)”到達(dá)相應(yīng)靶細(xì)胞，直接或間接調(diào)控靶細(xì)胞的生理功能，在細(xì)胞間發(fā)揮相應(yīng)的生物活性作用。二、外泌體與BPD（一）從間充質(zhì)干細(xì)胞過渡至外泌體間充質(zhì)干細(xì)胞可由多種組織中分離而來，具有強大的分化潛能，是目前為止唯一被動物實驗及初步臨床研究證實可有效治療BPD的物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，氣道輸送或靜脈注射的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過抗炎、促血管生成的作用防止高氧誘導(dǎo)的肺泡和肺微血管生長受損，保留肺功能［16-17］。韓國開展的一項針對9例胎齡25周早產(chǎn)兒的Ⅰ期臨床試驗及針對66例胎齡23～24周早產(chǎn)兒進(jìn)行的Ⅱ期臨床試驗中，使用人血源性間充質(zhì)干細(xì)胞治療BPD，證實了氣管內(nèi)吸入人血源性干細(xì)胞治療BPD的安全性及可行性，并表明間充質(zhì)干細(xì)胞可降低炎性因子水平［18-20］，這也為干細(xì)胞臨床治療BPD提供了新的思路。然而，干細(xì)胞輸送、培養(yǎng)、傳代及大規(guī)模生產(chǎn)等一系列問題導(dǎo)致其目前難以應(yīng)用于臨床。最初認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞是通過歸巢至損傷肺并分化為肺組織細(xì)胞，進(jìn)而取代受損細(xì)胞而發(fā)揮對損傷肺的保護(hù)性作用，但隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞在肺部只能短暫停留，且不能保證正確分化為目的細(xì)胞［21-22］。隨后進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞對受損肺組織發(fā)揮保護(hù)作用可能是干細(xì)胞通過外泌體以旁分泌途徑進(jìn)行細(xì)胞器如線粒體等的轉(zhuǎn)移以及調(diào)節(jié)修復(fù)因子的分泌來完成的［23-24］，證明了外泌體具有與干細(xì)胞一樣的肺保護(hù)作用［25］，可促進(jìn)肺泡分化［26］，且其保護(hù)效能可能大于親本細(xì)胞［27-28］。因此，外泌體成為治療BPD的新的研究焦點，與其他傳統(tǒng)的治療方法相比，外泌體具有合成簡單、直接、免疫原性低、毒性?。?9］等優(yōu)點，是基于無細(xì)胞治療的新方法，也是一個潛在的極其理想的遞質(zhì)及藥物呈遞系統(tǒng)。（二）外泌體在防治BPD中的作用機制1.抗炎效應(yīng)：機械通氣、氧毒性和感染引起的炎癥是BPD發(fā)病中的關(guān)鍵因素，嬰兒氣管抽吸物中存在多種促炎和趨化因子，這種炎性環(huán)境可引發(fā)一系列復(fù)雜的反應(yīng)，導(dǎo)致肺泡和血管發(fā)育的停止，最終導(dǎo)致BPD，表現(xiàn)為肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞功能喪失［30］。使用炎性介質(zhì)相關(guān)受體阻滯劑可以改善BPD的發(fā)病情況［31］，但目前使用炎癥調(diào)節(jié)劑治療BPD尚缺乏足夠的證據(jù)［32］。巨噬細(xì)胞是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，參與炎癥的各個環(huán)節(jié)。根據(jù)活化狀態(tài)、功能以及分泌因子的不同，巨噬細(xì)胞可分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和選擇性活化的M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞常表達(dá)腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6，發(fā)揮促炎作用；M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)精氨酸酶和甘露糖受體，與抗炎、促修復(fù)、促進(jìn)重塑有關(guān)。巨噬細(xì)胞的不同活化狀態(tài)代表了其對發(fā)育、免疫激活等方面作用的不同［33］。有研究將人類臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體與小鼠M1型及M2型肺泡巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可顯著降低M1型標(biāo)記物——腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6微RNA的水平，并顯著提高M(jìn)2型巨噬細(xì)胞精氨酸酶的表達(dá)水平，且反應(yīng)呈劑量依賴性［25］。另一項研究也發(fā)現(xiàn)，人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可抑制大鼠M1型肺泡巨噬細(xì)胞促炎標(biāo)記物如腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6的表達(dá)水平，并可改變體內(nèi)外實驗中M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)，如甘露糖受體和精氨酸酶-1［28］。人類脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可在體外通過上調(diào)人外周血M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化［34］?？傊饷隗w可被巨噬細(xì)胞吸收，促使高氧狀態(tài)下M1型巨噬細(xì)胞逆轉(zhuǎn)向M2型巨噬細(xì)胞。腫瘤壞死因子刺激蛋白-6是一種糖蛋白，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。有研究通過向高氧處理的幼鼠氣管內(nèi)注射腫瘤壞死因子刺激蛋白-6，發(fā)現(xiàn)幼鼠肺部核因子-κB和炎癥標(biāo)記物表達(dá)降低，并可改善肺泡形成、肺血管生成、肺血管重塑和肺動脈高壓［35］。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可通過介導(dǎo)腫瘤壞死因子刺激蛋白-6的表達(dá)來減輕炎癥反應(yīng)，降低新生小鼠BPD的程度，從而發(fā)揮對肺組織的保護(hù)作用［23］。一項研究對小鼠全肺的基因進(jìn)行測序，進(jìn)一步驗證了間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以降低促炎基因的表達(dá)，尤其是那些參與白細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)的基因［36］。2.抗氧化應(yīng)激效應(yīng)：高氧是引起B(yǎng)PD的主要原因之一，早產(chǎn)兒由于抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)不完善，對高氧耐受性差，易受到活性氧介導(dǎo)的損傷而導(dǎo)致肺泡發(fā)育延遲及阻斷遠(yuǎn)端肺組織毛細(xì)血管的形成［37］。線粒體不僅是活性氧的主要來源，還是氧化損傷的主要對象，活性氧可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞線粒體功能障礙和氧化磷酸化缺陷［38］。體外細(xì)胞實驗表明人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可釋放含有去極化線粒體的細(xì)胞外囊泡，介導(dǎo)線粒體的轉(zhuǎn)移來影響小鼠巨噬細(xì)胞的表型，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激；且這些囊泡可被巨噬細(xì)胞吞噬融合后重新利用，來增強巨噬細(xì)胞的生物能量；此外，該項研究還表明間充質(zhì)干細(xì)胞同時釋放含有微小RNA的外泌體，可通過抑制Toll樣受體信號的表達(dá)來抑制巨噬細(xì)胞的激活，從而增強巨噬細(xì)胞對線粒體轉(zhuǎn)移的耐受性［39］。3.促再生修復(fù)效應(yīng)：相比于“經(jīng)典型BPD”，“新BPD”更突出的是肺血管和肺泡發(fā)育不成熟，是由于胎齡28周的早產(chǎn)兒，肺發(fā)育階段處于肺囊泡期，肺部解剖結(jié)構(gòu)及生理功能不成熟，易受到外源性因素的影響，造成肺發(fā)育停滯，表現(xiàn)為肺泡簡單化和肺微血管發(fā)育停滯［2，6］。肺微血管發(fā)育停滯是BPD的重要病理特征。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體中包含許多與血管生長相關(guān)的細(xì)胞因子。血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）與VEGF受體2是肺發(fā)育過程中血管生成的重要信號，VEGF可磷酸化VEGF受體2，其下游的信號通路可激活一氧化氮合酶，阻斷該通路可增強內(nèi)皮細(xì)胞中的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，從而使內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生障礙。一項研究通過α平滑肌肌動蛋白染色證實了高氧暴露下小鼠的肺周圍血管肌化增強，而人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體治療可有效改善高氧誘導(dǎo)的血管肌化，并且能有效改善受損肺的功能［15］。另一項動物研究進(jìn)一步將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過腹腔注射的途徑作用于BPD大鼠模型，發(fā)現(xiàn)外泌體可介導(dǎo)VEGF的表達(dá)，從而增加外周血管的形成［40］。最近，國內(nèi)一項研究發(fā)現(xiàn)大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞來源外泌體可通過影響VEGF、VEGF受體2和一氧化氮合酶的表達(dá)，從而改善氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、形成和細(xì)胞遷移等功能，以促進(jìn)血管生成［41］。一項研究對比人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體與敲除VEGF后人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體治療暴露于高氧d的新生大鼠的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可減少肺血管生成受損，而這種保護(hù)作用主要是通過外泌體攜帶VEGF的轉(zhuǎn)移所介導(dǎo)的［42］。肺泡發(fā)育受阻及肺泡簡單化是BPD發(fā)展過程中的另一個重要病理特征。一項研究利用處于肺發(fā)育囊泡期階段的小鼠模擬高氧BPD模型，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可部分修復(fù)新生小鼠BPD的病理改變，通過對肺平均內(nèi)襯間隔、肺泡壁厚度、肺泡間隔厚度進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)外泌體可以從根本上減少肺纖維化及肺泡簡單化，防止肺泡生長中斷［40，43］。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞是BPD肺上皮損傷的關(guān)鍵靶細(xì)胞，有研究表明肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的過度凋亡是肺泡發(fā)育不良的關(guān)鍵因素，近來有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體中含有抗凋亡蛋白，國外有研究通過體內(nèi)及體外實驗證明了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過氣管內(nèi)給藥被肺組織吸收而發(fā)揮抗凋亡的作用，表現(xiàn)為肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞及肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞增加，改善了大鼠BPD模型的肺泡形成和血管生成，且可能與人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因調(diào)控蛋白激酶B（phosphataseandtensionhomologdeletedonchromosometen/proteinkinaseB，PTEN/Akt）信號通路相關(guān)［44］。更為直接的是，有研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基可保護(hù)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞免受高氧誘導(dǎo)的DNA損傷和凋亡，加速肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷恢復(fù)，增強內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的形成，從而起到逆轉(zhuǎn)BPD病理特征的作用［45］。4.降低肺動脈高壓效應(yīng)：胎齡28周的早產(chǎn)兒正處于肺部發(fā)育的關(guān)鍵時期，出生后肺囊泡期中斷，肺發(fā)育不成熟，自主呼吸功能不完善，加之生后的醫(yī)源性因素，可進(jìn)一步加重肺損傷，甚至發(fā)展為肺動脈高壓。BPD患兒長期存在發(fā)展為肺源性肺動脈高壓的風(fēng)險，BPD患兒右心室肥厚的比例高達(dá)25%～40%，而確診為BPD并伴有肺動脈高壓的嬰兒在幼兒期的死亡風(fēng)險明顯增加［46］。有研究給高氧誘導(dǎo)的BPD小鼠模型注射骨髓來源的純化外泌體，然后測量右心室收縮壓、右心室與體重的比值和Fultons指數(shù)，以評估肺動脈高壓的程度，發(fā)現(xiàn)外泌體干預(yù)后以上指標(biāo)均有所改善，說明骨髓來源外泌體可降低肺動脈高壓，改善肺血管重構(gòu)［28］。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可逆轉(zhuǎn)野百合堿所誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓，降低右心室收縮壓及右心室肥厚指數(shù)，抑制肺血管重構(gòu)，改善右心室肥厚，其機制可能與抑制肺血管重構(gòu)及內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有關(guān)［47］。同樣，一項基于動物的BPD與肺動脈高壓的相關(guān)研究對納入的52項研究進(jìn)行meta分析，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可降低右心室收縮壓及改善右心室肥厚，從而降低肺動脈高壓［48］。三、展望在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，大量研究已表明外泌體對BPD具有強大的防治功能，包括抗炎、修復(fù)再生、降低肺動脈高壓，進(jìn)而改善BPD患兒的生活質(zhì)量，但不可避免的是，上述研究均存在一定的局限性。首先，難以標(biāo)準(zhǔn)化外泌體的提取及純化過程；其次，難以精確分析外泌體所攜帶的大量“生物活性物質(zhì)”的組成成分