淺談基因測序技術(shù)的發(fā)展及其在腫瘤中的應(yīng)用

淺談基因測序技術(shù)的發(fā)展及其在腫瘤中的應(yīng)用張梓堃【期刊名稱】《《化工中間體》》【年(卷)，期】2019(000)002【總頁數(shù)】3頁(P148-150)【關(guān)鍵詞】基因測序技術(shù);腫瘤;基因;個(gè)性化治療【作者】張梓堃【作者單位】山東省淄博第四中學(xué)山東255100【正文語種】中文【中圖分類】T腫瘤已經(jīng)成為中國人的〃家常病”，惡性腫瘤，也就是癌癥，在中國已經(jīng)成為發(fā)病率第二的疾病，根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，每天約有1萬人被確認(rèn)為癌癥。惡性腫瘤往往因?yàn)榍捌诎Y狀不明顯，擴(kuò)散速度極快，在治療上成為一大難題。目前臨床上主要是采用腫瘤切除加化療的方式進(jìn)行腫瘤治療，但是腫瘤切除往往針對(duì)的是良性腫瘤，如果是惡性腫瘤除了切除以外，患者往往還需要化療，雖然化療對(duì)于惡性腫瘤的治療成功率相對(duì)較高，但是化療期間患者十分痛苦，脫發(fā)、惡心、腹痛等，經(jīng)受這些對(duì)于患者本身來說也是一種極大的心理壓力，而且化療方式對(duì)一些癌癥的治療效果并不顯著，像在膽囊癌的治療，因此需要從基因水平上掌握癌癥的發(fā)病機(jī)理及生物學(xué)行為，有助于癌癥的治療。經(jīng)過科學(xué)家的不斷努力，最終發(fā)現(xiàn)由于多基因發(fā)生改變及多基因共同作用，造成了癌癥的發(fā)生，因此，在臨床上，要想通過單一的基因改變來對(duì)腫瘤進(jìn)行篩查從而達(dá)到預(yù)防診斷的目的，對(duì)于臨床醫(yī)生來說是相對(duì)困難的。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，一系列研究手段也層出不窮，其中基因測序技術(shù)的出現(xiàn)，對(duì)腫瘤的篩查、預(yù)防及診斷具有一定的推進(jìn)作用。本文對(duì)基因測序技術(shù)的發(fā)展及近幾年臨床上腫瘤方面的應(yīng)用，進(jìn)行簡單的概括總結(jié)?；驕y序技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程基因測序技術(shù)發(fā)展到如今，已經(jīng)過去70多年了，從最初的高成本、高耗時(shí)，到現(xiàn)在成本逐步降低，速度快、高通量，各大醫(yī)院也開始使用基因測序的技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，腫瘤篩查等工作。第一代基因測序技術(shù)化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法是由MAXAM和GILBERT發(fā)明，其原理：組成DNA片段的不同堿基可以被一些化學(xué)試劑進(jìn)行修飾，使連接兩個(gè)脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，由于化學(xué)試劑的不同，斷裂的堿基也就不同，在斷裂的同時(shí)將磷酸基團(tuán)標(biāo)記，然后利用凝膠電泳技術(shù)，比對(duì)長度不一的DNA片段，從而得到目的DNA的序列。該方法沒有酶的參加，不會(huì)受到因?yàn)槊阜磻?yīng)而造成的誤差，但操作繁瑣，化學(xué)試劑毒性較大，放射性同位素標(biāo)記效率偏低以至于讀取時(shí)間過長，人工讀取數(shù)據(jù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力成本過高。雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法是由Sanger于1970年提出，該方法是采用了ddNTP與dNTP共同參與DNA復(fù)制的過程，但是由于ddNTP是雙脫氧核糖核苷酸，不能參與DNA的復(fù)制過程，從而使DNA復(fù)制過程的結(jié)束，然后產(chǎn)生不同長度的DNA復(fù)制鏈，對(duì)這些鏈進(jìn)行電泳分離，通過大量統(tǒng)計(jì)便可獲得DNA序列。對(duì)于Sanger法來說，在進(jìn)行凝膠電泳過程中，是否能把各個(gè)長短不一的DNA片段進(jìn)行有效的分離，達(dá)到一定的分離度，是該方法的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。第二代基因測序技術(shù)454測序技術(shù)454測序儀是Roche公司經(jīng)過一系列的改進(jìn)，在Sanger法的基礎(chǔ)上研發(fā)推出的，其工作過程是將dNT參與的PDNA復(fù)制過程與化學(xué)信號(hào)相關(guān)聯(lián)，在這過程中有DNA聚合酶、雙磷酸酶、熒光素酶及ATP酶的參與，測序過程中通過檢測熒光素酶是否產(chǎn)生熒光以及產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)弱程度來實(shí)現(xiàn)DNA片段測序，可以做到實(shí)時(shí)檢測DNA序列。此技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)就是讀長很長，而且操作簡單，不過沒有辦法準(zhǔn)確測量同聚物的長度。Solexa測序技術(shù)Illumina公司的新一代測序儀?；驹恚簩⒋郎y的DNA片段通過一定的手段處理能夠吸附在透明的玻璃表面，先將這些DNA片段進(jìn)行大規(guī)模的橋式擴(kuò)增，然后使用帶有熒光標(biāo)記的四種不同的脫氧核糖核苷酸，以擴(kuò)增后的DNA片段為模板，再次進(jìn)行擴(kuò)增，然后再對(duì)DNA的序列進(jìn)行測定。Solexa技術(shù)雖然可以獲得高精準(zhǔn)度高品質(zhì)的DNA序列，但是其無法測量長度較長的DNA片段，但低成本和邊合成邊測序技術(shù)還是使其廣泛應(yīng)用于市場。SOLID測序技術(shù)美國生物系統(tǒng)公司在2007年推出了SOLID測序儀，該測序儀的原理是使用連接酶法進(jìn)行測序，然后通過將不同熒光探針連接在底物是8堿基單鏈上，通過檢測熒光探針從而達(dá)到測序的目的，但是該技術(shù)在測序過程中容易發(fā)生解碼錯(cuò)誤。第三代基因測序技術(shù)通過比較第一代和第二代基因測序技術(shù)，我們可以發(fā)現(xiàn)，它們都需要通過PCR獲得大量的DNA，需要的樣品較多，但是在進(jìn)行DNA的PCR過程中，很容易出現(xiàn)堿基互補(bǔ)配對(duì)出現(xiàn)錯(cuò)誤等現(xiàn)象，為了降低這些錯(cuò)誤發(fā)生的概率，科研人員不斷的對(duì)基因測序技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)和創(chuàng)新，因此，第三代基因測序儀就產(chǎn)生了。PacificBioscienceSMRT技術(shù)Pacific公司2011年推出了只測DNA單鏈的第三代測序技術(shù)，通俗來說就是DNA單分子實(shí)時(shí)測序(singlemoleculerealtimeDNAsequencing)技術(shù)。該公司使用不同的熒光將合成DNA的原料堿基進(jìn)行標(biāo)記，DNA經(jīng)過零模波導(dǎo)孔進(jìn)行復(fù)制時(shí)，通過觀察光的波長及峰值來判斷堿基的種類，從而達(dá)到檢測DNA序列的目的。該測序需要的樣品量較少，不需要通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)減少了試劑的使用，降低了成本，減少了所需時(shí)間。除此之外，該技術(shù)可以直接測定DNA片段，不受DNA片段長度的限制。Heliscope單分子測序該測序技術(shù)采用了比較靈敏的熒光探測儀可以直接對(duì)在合成的DNA片段進(jìn)行測序，該測序技術(shù)對(duì)DNA片段的測定是不同步的，同時(shí)該技術(shù)沒有終止的基因，會(huì)一直持續(xù)測序下去，由于在測序過程中加入大量的堿基，所以準(zhǔn)確率較低。OxfordNanoporeTechnologies的納米孔單分子測序技術(shù)該技術(shù)主要是依據(jù)電信號(hào)的變化來進(jìn)行DNA片段測序，而不像以前的技術(shù)通過光信號(hào)檢測，該技術(shù)首先設(shè)計(jì)了一個(gè)納米孔，納米孔中有分子接頭，當(dāng)DNA經(jīng)過納米孔的時(shí)候，會(huì)使孔內(nèi)的電流發(fā)生短暫的變化，從而根據(jù)電流變化強(qiáng)度來判斷DNA片段中的堿基。該技術(shù)對(duì)起始的DNA序列不產(chǎn)生破壞，且讀取的數(shù)據(jù)也是可以時(shí)測時(shí)讀，錯(cuò)誤率在百分之一到四之間，樣品制作便宜簡單，可以對(duì)RNA序列直接讀取?；驕y序技術(shù)在腫瘤中應(yīng)用及前景在對(duì)腫瘤的分子生物學(xué)及發(fā)病機(jī)制的研究過程中，基因芯片使科研人員改變了研究方向，原來研究腫瘤發(fā)生的單一或者說是少數(shù)的分子，而現(xiàn)在轉(zhuǎn)移到多分子上，認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是多種分子共同作用的結(jié)果。而基因測序技術(shù)相比基因芯片來說，可以實(shí)現(xiàn)高通量，低成本。對(duì)腫瘤的基因組進(jìn)行研究可以得到以下結(jié)論：①發(fā)現(xiàn)易感基因，實(shí)現(xiàn)癌癥預(yù)防；②發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)基因，通過新藥研發(fā)，提供高效治療的可能；③通過數(shù)據(jù)支持，實(shí)現(xiàn)從廣譜抗癌到靶向治療，再到多靶點(diǎn)治療的個(gè)體化治療模式?；驕y序技術(shù)在腫瘤的應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：腫瘤的預(yù)防、診斷及治療。預(yù)防方面的應(yīng)用通過對(duì)腫瘤基因組進(jìn)行測序，可以篩查出易感基因?？茖W(xué)家通過對(duì)乳腺癌的基因組進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示由于基因BRCA1/2發(fā)生了突變，才導(dǎo)致乳腺癌和卵巢癌這兩種腫瘤的發(fā)生。因此，在生活中如果人們擔(dān)心自己是否容易患有乳腺癌，可以通過基因測序的方法檢測自身基因中是否存在BRCA1基因突變，如果存在則說明比較容易患有乳腺癌和卵巢癌，像好萊塢影星安吉麗娜.朱莉通過對(duì)自身基因進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)自身存在BRCA1基因，且家族史中有2位女性長輩因此而離世，因此在醫(yī)生的建議下將乳腺及卵巢進(jìn)行了切除，期望能夠預(yù)防乳腺癌和卵巢癌。隨著研發(fā)人員的不斷努力和創(chuàng)新，將基因測序技術(shù)也推向了一個(gè)高潮，隨之而來的就是出現(xiàn)了很多大大小小的基因測序公司，其中以華大基因?yàn)槭??；驕y序技術(shù)的改進(jìn)和發(fā)展降低了測序所需成本，縮短了測序時(shí)間，吸引了越來越多像安吉麗娜.朱莉攜帶某些癌癥高風(fēng)險(xiǎn)人群或者是已經(jīng)患病的人群開始進(jìn)行個(gè)人基因組測序，但是對(duì)于普通人來說，是不是有必要進(jìn)行腫瘤易感基因的篩查，針對(duì)這個(gè)問題，仍然存在很多不同的看法。診斷方面的應(yīng)用由于腫瘤的發(fā)生機(jī)制是復(fù)雜的，不僅體現(xiàn)在人們對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)有限，同時(shí)還體現(xiàn)在腫瘤的臨床診斷標(biāo)志物也很少，因此，臨床醫(yī)生不能準(zhǔn)確的對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷，往往因此而耽誤了腫瘤治療的最佳時(shí)機(jī)，使很多腫瘤患者失去了生命。FENG等人對(duì)45個(gè)肺癌患者標(biāo)本的737個(gè)基因進(jìn)行靶向測序，最終發(fā)現(xiàn)與肺癌相關(guān)的突變基因主要是TP53，PIK3CK，KRAS和EGFR，而且通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在一些患者的標(biāo)本中，這些基因有的會(huì)發(fā)生兩個(gè)或者三個(gè)突變。通過研究發(fā)現(xiàn)，由于肺癌的類型不同，往往發(fā)生的基因突變也不相同，通過靶向測序可以識(shí)別這些突變基因，因此可以進(jìn)行靶向治療?？茖W(xué)家在對(duì)急性髓細(xì)胞白血病研究的過程中，發(fā)現(xiàn)FLT3是不是治療該病的有效靶標(biāo)一直存在著諸多不同的意見。使用單分子測序技術(shù)對(duì)產(chǎn)生耐藥性的患者的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)的耐藥性與FLT3基因下游出現(xiàn)的稀有突變存在一定的關(guān)系，通過使用基因測序技術(shù)又重新證明了FLT3基因確實(shí)是治療急性髓細(xì)胞白血病的有效靶標(biāo)。(3)治療方面的應(yīng)用腫瘤治療目前主要是藥物靶向治療，但是由于個(gè)人之間的差異，藥物并不能適用于所有人。因此在對(duì)于腫瘤的治療需要尋找藥物的特定的靶點(diǎn)，或者是研發(fā)出新藥，臨床醫(yī)生能夠根據(jù)個(gè)人的身體制定新的治療方案，通過改變藥物的劑型等來提高藥物的療效。通過對(duì)非小細(xì)胞肺癌的研究，發(fā)現(xiàn)表皮生長因子(epidermalgrowthfactorreceptor)，是否發(fā)生突變影響對(duì)非小細(xì)胞肺癌的治療，如果EGFR受體發(fā)生了突變則患者在使用易瑞沙的時(shí)候，治療效果顯著，而沒有發(fā)生突變的患者治療效果不顯著，因此在腫瘤的治療過程中，以靶標(biāo)是否發(fā)生突變作為腫瘤患者治療的標(biāo)志物，可以更好的為患者提供個(gè)性化治療。耐藥是靶向治療目前面臨的主要障礙，基于新一代測序技術(shù)的全基因組化學(xué)誘變篩選可以無偏移地鑒定腫瘤細(xì)胞的耐藥突變，我們期待這些技術(shù)在新一代靶向藥物的開發(fā)和在耐藥機(jī)制的研究中發(fā)揮更大的作用。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展和不斷完善，一些癌癥研究所使用PacBioRS系統(tǒng)SMART技術(shù)對(duì)臨床上一些癌癥患者的樣本進(jìn)行了基因分析，同時(shí)測定了癌癥治療相關(guān)的敏感性或者是抗藥性的遺傳標(biāo)記，制定后續(xù)的癌癥治療方案，研究所在前期已經(jīng)做了大部分相關(guān)試驗(yàn)，積累了很多的數(shù)據(jù)，由于基因測序技術(shù)的發(fā)展，臨床上可以對(duì)腫瘤進(jìn)行大規(guī)模的測試，從而制定個(gè)性化治療。由于基因測序技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展，可以對(duì)腫瘤中DNA和RNA變化實(shí)現(xiàn)高通量、大規(guī)模的篩選，通過對(duì)這些變化進(jìn)行分析、比對(duì)，可以用來研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制，隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，可以早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療腫瘤。通過對(duì)患有家族性遺傳病人群或者是易患腫瘤的家族的基因組進(jìn)行分析，找出導(dǎo)致遺傳病或者是腫瘤發(fā)生的基因，以達(dá)到預(yù)防腫瘤或者遺傳性疾病的目的。根據(jù)檢測結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而根據(jù)患者制定個(gè)性化治療，像好萊塢影星安吉麗娜.朱莉通過切除乳腺和卵巢來降低乳腺癌和卵巢癌發(fā)生的概率?；驕y試技術(shù)的展望高通量測序技術(shù)仍處于開發(fā)的早期階段，但我們可以預(yù)見，這將是第三代測序技術(shù)快速發(fā)展的黃金時(shí)期，以及未來幾年內(nèi)三代測序技術(shù)將會(huì)共存。隨著新的測序技術(shù)的出現(xiàn)，測序成本將繼續(xù)下降。研制治療不治之癥的新藥，將會(huì)變得越來越容易。因此，不同領(lǐng)域的科學(xué)家在基因組或者是轉(zhuǎn)錄組的測序上花費(fèi)越來越少，以獲得更好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和獲得更多的新發(fā)現(xiàn)。此外，如何分析高通量測序技術(shù)產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)，并從中提取有價(jià)值的生物信息，將成為未來的一