淀粉酶的麩曲固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

《淀粉酶的麩曲固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)》設(shè)計(jì)方案〔王澤功〕淀粉酶屬于水解酶類，是催化淀粉、糖原、糊精中糖苷鍵水解的一類酶的統(tǒng)稱。淀粉酶是我國(guó)目前用途最廣泛、產(chǎn)量最大的工業(yè)酶制劑種類之一,在酶制劑生產(chǎn)中占有重要地位,應(yīng)用領(lǐng)域主要集中在淀粉加工業(yè)、紙漿制造、紡織工業(yè)、釀造酒精及飼料加工業(yè)等。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷鍵的酶。此類酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，幾乎全部動(dòng)物、植物和微生物中都含有淀粉酶。淀粉酶可由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，也可從植物和動(dòng)物中提取。目前，工業(yè)生產(chǎn)上都以微生物發(fā)酵法進(jìn)展大規(guī)模生產(chǎn)。主要的淀粉酶生產(chǎn)菌種有細(xì)菌和曲霉，霉菌的淀粉酶大多承受固體曲法生產(chǎn)。固體培育法生產(chǎn)淀粉酶以麩皮為主要原料，添加少量米糠或豆餅的堿水浸出液作為補(bǔ)充氮源。在相對(duì)9032～3536~48h40℃左右烘干或風(fēng)干即得工業(yè)用的粗酶。[1]固態(tài)發(fā)酵是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固體支持物，其體系無水或接近于無水的任何發(fā)酵過程。與其他培育方式相比，固態(tài)發(fā)酵具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)培育基簡(jiǎn)潔且來源廣泛，多為廉價(jià)的(2(3(4可大大削減生物反響器的體積，不需要廢水處理，環(huán)境污染較少，后處理加工便利；(5)發(fā)酵過程一般不需要嚴(yán)格的無菌操作。麩曲發(fā)酵生產(chǎn)工藝是接種純種霉菌菌種，以麩皮為原料制曲，在人為掌握的科學(xué)適宜的條件下進(jìn)展發(fā)酵。[2]米曲霉(Asp.oryzae)屬于真菌菌落生長(zhǎng)快，10d5-6cm，質(zhì)地疏松，初白色、黃色，后變?yōu)楹?50-300μm，也有少數(shù)為疏松柱狀。分生孢子梗2mm左右。近頂囊處直徑可達(dá)12-25μm，壁薄，粗糙。頂囊近球形或燒瓶形，通常40-50μm。上覆小梗，小梗一般為單層，12-15μm，間或有雙層，也有單、雙層小梗同時(shí)存在于一個(gè)頂囊上。分生孢子幼時(shí)洋梨形或卵圓形，長(zhǎng)大后多變?yōu)榍蛐位蚪蛐?，一?.5μm，粗糙或近于光滑。菌落生長(zhǎng)較快，質(zhì)地疏松。初呈白色、黃色，后轉(zhuǎn)黃褐色至淡綠褐色，反面無色，分布甚廣，主要在糧食、發(fā)酵食品、腐敗有機(jī)物和土壤等處。是我國(guó)傳統(tǒng)釀造食品醬和醬油的生產(chǎn)菌種。也可生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和曲酸等。會(huì)引起糧食等工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品霉變。[3]米曲霉(Aspergillusoryzae)具有豐富的蛋白酶系,能產(chǎn)生酸性、中性和堿性蛋白酶,其穩(wěn)定性高,能耐受較高的溫度,廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及飼料等工業(yè)中。米曲霉是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，將原料中的直鏈、支鏈淀粉降解為糊精及各種低分子糖類，如麥芽糖、葡萄糖等。[4]淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷鍵水解，產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖等。在基質(zhì)充分的條件下，反響后參加的碘液與未被水解的淀粉結(jié)合成藍(lán)色復(fù)合物，其藍(lán)色深淺與未經(jīng)酶促反響的空白管比較其吸光度，從而推算出淀粉酶的活力單位。[5]酶活力也稱酶活性，是以酶在最適溫度、最適pH等條件下，催化肯定的化學(xué)反響的初速度來表示。本試驗(yàn)是以肯定量的淀粉酶液，于40°C、pH4.0的條件下，在肯定的初始作用時(shí)間里水解淀粉，比色測(cè)定，求得淀粉的水解量，即酶的活力?！矃切窃隆?、菌種：米曲霉〔試驗(yàn)室供給〕2、試驗(yàn)器材：設(shè)備：離心機(jī)11恒溫培育箱1高壓滅菌鍋1無菌操作臺(tái)1周密天平1電爐1烘箱1臺(tái)；顯微鏡1可見分光光度計(jì)1器皿：試管50mL、100mL5錐形瓶250mL、500mL210血細(xì)胞計(jì)數(shù)板1蓋玻片225mL150mL，250mL，500mL2移液管1mL、2mL、5mL2吸耳球1璃棒1100、250，500mL11擦鏡紙10離心管50mL2酒精燈11個(gè)；紗布10*30cm；棕色瓶500mL1細(xì)口瓶500mL4搪瓷缸500mL一個(gè)；等。3、試劑及培育基：蒸餾水；75%酒精：9575ml20ml。將水參加乙醇里，玻璃棒將其混勻，導(dǎo)入瓶?jī)?nèi)。[6]H2SO40.1mol/L=1.84g/ml98c(H2SO4)=18.4mol/L移0.543mL100mL[7]淀粉溶液0.5：稱取5g可溶性淀粉，溶于1000mL[8〔臨用前配制〕稀碘液：稱取分析純結(jié)晶碘11g，分析純碘化鉀22g，混合后，先用少量純化水使碘完全溶解后，再加500mL2mL20g，混合后，加純化水溶解定容至500mL，貯于棕色瓶?jī)?nèi)。[9]NaCl溶液0.9。稱取0.9克氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，稀釋到100121℃，20min種子培育基g/：蔗糖3NaNO3MgSO7H2O0.FeSO7H2O0.0K2HPO3H2O，KCl0.5，瓊脂20，PH[11]按培育基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取所需藥品參加到搪瓷缸。在稱取時(shí)動(dòng)作要快速，防潮。另外，稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜。可先參加少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在電爐上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。將配制的培育基分裝入試管內(nèi)。分裝過程中留意不要使培育基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面。培育基分裝完畢后，在試管口塞上棉塞，以阻擋外界微生物進(jìn)入培育基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。加塞后，將全部試管用麻繩捆扎好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號(hào)筆注明培育基名稱、組別、日期。包扎好的試管在121.3℃，20分鐘的條件下高壓蒸汽滅菌。如因特別狀況不能準(zhǔn)時(shí)滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。將滅菌的試管培育基冷至50℃左右，將試管棉塞端擱在玻棒上，擱置的斜面長(zhǎng)度以不超過試管總長(zhǎng)的一半3724～48250ml82K2HPO3H2O0.MgSO7H2O0.(NH4)2SO41％，蒸餾水10ml，PH[11]按培育基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取所需藥品參加到錐形瓶中。在稱取時(shí)動(dòng)作要快速，稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜?？上葏⒓由儆谒枰乃浚貌０魯噭颉４幤吠耆芙夂?，補(bǔ)充水分到所需的總體積。瓶口上塞上棉塞，以阻擋外界微生物進(jìn)入培育基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。錐形瓶瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時(shí)簡(jiǎn)潔解開，同樣用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。包扎好后在121.3℃，20分鐘的條件下高壓蒸汽滅菌。如因特別狀況不能準(zhǔn)時(shí)滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。將滅菌的培育基放入3724～48留意：試劑及培育基配置按實(shí)際配置。〔楊雪輝〕1、各種所需藥品、試劑、培育基的配置。配方級(jí)配置方法見〔二、3。相關(guān)器材〔紗布、錐形瓶、試管、玻璃珠等〕在121.3℃，20分鐘的條件下高壓蒸汽滅菌。步驟：①開蓋：向左轉(zhuǎn)動(dòng)手輪數(shù)圈，直至轉(zhuǎn)動(dòng)到頂，使鍋蓋充分提起，拉起左立柱上的保險(xiǎn)銷，向右推開橫梁移開鍋蓋。②通電：接通電源，此時(shí)欠壓蜂鳴器響，顯示本機(jī)鍋內(nèi)無壓力〔當(dāng)鍋內(nèi)壓力升至約0.03Mpa時(shí)蜂鳴器自動(dòng)關(guān)閉，掌握面板上的低水位燈亮，鍋內(nèi)屬斷水狀態(tài)。③加水：將純水或生活用水直接注入蒸發(fā)鍋內(nèi)約8升，同時(shí)觀看掌握面板上的水位燈，當(dāng)加水至低水位燈滅，高水位燈亮?xí)r停頓加水。當(dāng)加水過多覺察內(nèi)膽有存水，開啟下排汽閥放去內(nèi)膽中的多余水量。④放樣：將培育基堆放在滅菌筐內(nèi)，各包之間留有間隙，有利于蒸氣的穿透，提高滅菌效果。密封：把橫梁推向左立柱內(nèi)，橫梁必需全部推入立柱槽內(nèi)，手動(dòng)保險(xiǎn)銷自動(dòng)下落鎖住橫梁，旋緊鍋蓋。⑤設(shè)定溫度和時(shí)間：按一下確認(rèn)鍵，進(jìn)入溫度設(shè)定狀態(tài)，按上下鍵可以調(diào)整溫度值，再次按下確認(rèn)鍵，進(jìn)入時(shí)間設(shè)定狀態(tài)，按左鍵或上下鍵設(shè)置需要的時(shí)間，再次按動(dòng)確認(rèn)鍵，設(shè)定完成，儀器進(jìn)入工作狀態(tài)，開頭加熱升溫。2、擴(kuò)大培育。將所需器材放入無菌操作臺(tái)，提前半小時(shí)翻開風(fēng)機(jī)，紫外線燈。操作前，先用75%酒精擦手，待酒精揮發(fā)后點(diǎn)燃酒精燈。將菌種管和斜面握在左手大姆指和其它四指之間，使斜面和有菌種的一筆一樣)，以火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管其余部位也過火滅菌。用右手的無名指、小指和手掌將菌種管和待接斜面試管的棉花塞或試管帽同時(shí)拔出然后讓試管口緩緩過火滅菌(切勿燒過燙)。將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，接種環(huán)在試管內(nèi)壁或未長(zhǎng)菌苔的培育基上接觸一下，讓其充分冷卻，然后輕輕刮取少許菌苔，再?gòu)木N管內(nèi)抽出接種環(huán)。快速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管。從斜面底部向上作“Z”形來回密集劃線。有時(shí)也可用接種針僅在培育基的中心拉一條線來作斜面接種，以便觀看菌種的生長(zhǎng)特點(diǎn)。接種完畢后抽出接種環(huán)灼燒管口，塞上棉塞。將接種環(huán)燒紅滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。接種好后恒溫培育箱中303[11]3、孢子懸浮液的制備。將所需器材放入無菌操作臺(tái)，提前半小時(shí)翻開風(fēng)機(jī)，紫外線燈。操作前，先用75有菌種的一面對(duì)上，并處于水平位置。先將菌種和斜面的棉塞旋轉(zhuǎn)一下，以便接種時(shí)便于拔出〔無菌操作可參考步驟2〕50ml無菌生理鹽水〔少量屢次〕洗下孢子，無菌條件下用紗布過濾至帶玻璃珠的無菌錐形瓶中搖勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將清潔枯燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細(xì)滴管將搖勻的菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，用吸水紙吸去多余水液。由蓋玻片邊緣或槽內(nèi)參加計(jì)數(shù)板來回推壓蓋玻片，使其緊貼在計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)室內(nèi)不能有氣泡。靜置5-10分鐘。在低倍鏡下找到小方格網(wǎng)后更換高倍鏡觀看計(jì)數(shù)，上下調(diào)動(dòng)細(xì)螺旋，以便看到小室內(nèi)不同深度的菌體。位于分格線上的菌體，只數(shù)兩條邊上的，其余兩邊不計(jì)數(shù)。如數(shù)上線就不數(shù)下線，數(shù)左邊線就不數(shù)右邊線。當(dāng)芽孢菌體到達(dá)母細(xì)胞大小的二分之一時(shí)，可記作兩個(gè)細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)假設(shè)使25×16〔大格4〔10016×25〔大格〕41〔805-10個(gè)為宜，如菌液過濃可適當(dāng)稀釋。每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2-3次，取其平均值，按下式計(jì)算樣品中的菌數(shù)。計(jì)數(shù)完畢，將計(jì)數(shù)板在水龍頭下沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用電吹風(fēng)吹干。計(jì)數(shù)時(shí)，如果使用16×25的計(jì)數(shù)板，要按對(duì)角線方位取左上、左下、右上、右下上述4個(gè)中格進(jìn)展計(jì)數(shù)〔100個(gè)小格中的細(xì)胞數(shù)〕25×164180〔1〕16×25/ml=100/100×400×10000×稀釋倍數(shù)〔2〕25×16格的細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/ml=80小格內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)/80×400×10000×稀釋倍數(shù)依據(jù)測(cè)出的數(shù)據(jù)將稀釋成孢子濃度約為1×107/ml[11]475%酒精擦手。用移液管取5ml30℃培育84h。[15]期間每天定時(shí)觀看培育基，菌落質(zhì)地疏松，初呈白色、黃色，后轉(zhuǎn)黃褐色至淡綠褐色。發(fā)酵完成后，取5g發(fā)酵培育物〔麩曲〕于250mL錐形瓶中，參加100ml4000r/min10min，過濾，取上清液即為粗酶液。[11][12]〔栗曉亮〕5mL4010min0.5ml5min一試管取0.5ml5mL0.1mol/LH2SO40.5ml5ml5min660nm處測(cè)定光密度值。用0.5ml蒸餾水代替0.5ml酶液為比照組，并依據(jù)上述方法進(jìn)展操作。以蒸餾水作空白組。測(cè)定上述三組溶液吸光度值，作好記錄，屢次測(cè)量取平均值。5g〔1002h〕后，再次稱重，計(jì)算麩曲含水率。酶活力定義:在40℃，pH4.0條件下，1min，1g干曲水解1mg淀粉的酶量為1個(gè)活力單位，以U表示。計(jì)算公式為:酶活力(U/g)=(A－Ｒ)×M×1000×10/［A×T×(1－β)］式中:A、Ｒ代表比照和反響液的光密度;MT為反響時(shí)間;V為酶液的體積;β 為含水率。〔孔真強(qiáng)〕1、試驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵你認(rèn)為是什么？為什么？2、培育基的pH為什么是自然pH？35min？4、本試驗(yàn)最易產(chǎn)生對(duì)結(jié)果有較大誤差影響的操作是哪些步驟？為什么？怎樣的操作策略可以盡量削減誤差？5、要使本試驗(yàn)更準(zhǔn)確應(yīng)如何優(yōu)化？〔林曉雨〕[1]谷軍.α-淀粉酶的生產(chǎn)與應(yīng)用[J].生物技術(shù),1994,4(3):1-5.百度百科-固態(tài)發(fā)酵.“://baike.baidu/view/2766708.htm?fr=aladdin“://baike.baidu/view/2766708.htm?fr=aladdin.趙龍飛,徐亞軍.米曲霉的應(yīng)用爭(zhēng)論進(jìn)展[J].中國(guó)釀造.2023(3):8-10.網(wǎng)摘.“://wenku.baidu/view/140670738e9951e79b89277f.html“://wenku.baidu/view/140670738e9951e79b89277f.html.網(wǎng)摘.“://docin/p-318013870.html“://docin/p-318013870.html-各種化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制.“://wenku.baidu/view/be8ad31d10a6f524cc“://wenku.baidu/view/be8ad31d10a6f524ccbf8563.html.-各種化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制“://wenku.baidu/view/be8ad31d10a6f524ccf85“.://wenku.baidu/view/be8ad31d10a6f524ccf8563.html.網(wǎng)摘.-各種化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制“://wenku.baidu