熒光定量PCR基礎(chǔ)原理

熒光定量PCR基礎(chǔ)原理1/39○PCR擴(kuò)增理論模式○RealtimePCR理論基礎(chǔ)熒光定量PCR基礎(chǔ)原理2/39PCR是將樣本中微量DNA模版放大來(lái)研究模版特征。伴隨研究深入，要了解樣本中基因表示模式與疾病關(guān)系，就需要了解標(biāo)本中DNA原始拷貝數(shù)。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理3/39因?yàn)楦鞣N環(huán)境原因復(fù)雜相互作用，不一樣PCR反應(yīng)體系進(jìn)入平臺(tái)期時(shí)間和平臺(tái)期高低都有很大改變，即使是重復(fù)試驗(yàn)，各種條件基本一致，最終得到DNA拷貝數(shù)也往往不一樣。所以經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增DNA產(chǎn)物量不能反應(yīng)起始模板量真實(shí)情況。經(jīng)過(guò)凝膠電泳EB染色或者同位素標(biāo)識(shí)只能定量PCR終產(chǎn)物量，而不能定量起始DNA模版拷貝數(shù)。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理4/39實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一個(gè)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最終經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)不但實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA模板定量，而且含有靈敏度高，特異性和可靠性強(qiáng)，重復(fù)性好，自動(dòng)化程度高、無(wú)污染性等突出優(yōu)勢(shì)，所以被公認(rèn)為當(dāng)今世界用于臨床最先進(jìn)核酸分子診療技術(shù)。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理5/39PCR擴(kuò)增理論模式PCR中，伴隨擴(kuò)增周期增加，模板以指數(shù)方式進(jìn)行擴(kuò)增。PCR理論方程：N=N0×(1+E)nN:擴(kuò)增子數(shù)量N0:起始模板數(shù)量E：擴(kuò)增效率n:循環(huán)數(shù)此公式僅在指數(shù)擴(kuò)增期（20-30個(gè)循環(huán)）內(nèi)成立。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理6/39PCR分期——“S”形曲線對(duì)PCR擴(kuò)增過(guò)程詳細(xì)分析表明，PCR擴(kuò)增曲線可被分為三個(gè)經(jīng)典時(shí)期：早期背景擴(kuò)增期、中期指數(shù)擴(kuò)增期（或?qū)?shù)線形擴(kuò)增期），以及晚期平臺(tái)期熒光定量PCR基礎(chǔ)原理7/39理論上PCR過(guò)程中反應(yīng)產(chǎn)物是以指數(shù)規(guī)模增加，但實(shí)際PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)指數(shù)曲線，而是S形曲線；因?yàn)榘殡SPCR循環(huán)數(shù)增加，擴(kuò)增規(guī)?？焖僭龃螅琓aq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐步不敷需求，PCR效率降低，產(chǎn)物生成速度逐步減緩，最終進(jìn)入平臺(tái)期。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理8/39兩種定量方法熒光定量PCR基礎(chǔ)原理9/39熒光定量PCR基礎(chǔ)原理10/39兩種定量方法終點(diǎn)定量起點(diǎn)定量無(wú)規(guī)律對(duì)數(shù)期分析：平行性好終點(diǎn)產(chǎn)物數(shù)量：誤差大拐點(diǎn)產(chǎn)物數(shù)量：重現(xiàn)性好，誤差小影響原因多擴(kuò)增效率恒定，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性起始DNA量，更具意義重現(xiàn)性好，誤差小擴(kuò)增效率恒定，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性熒光定量PCR基礎(chǔ)原理11/39普通PCR技術(shù)檢測(cè)模式普通PCR儀器擴(kuò)增，約2.5小時(shí)瓊脂糖凝膠電泳，約1小時(shí)EB染色，約20分鐘紫外成像陰性陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果無(wú)法定量熒光定量PCR基礎(chǔ)原理12/39實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)模式熒光定量PCR儀器擴(kuò)增，約2小時(shí)檢測(cè)過(guò)程有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)光滑S型指數(shù)曲線，陽(yáng)性無(wú)S型指數(shù)曲線，陰性熒光定量PCR基礎(chǔ)原理13/39實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)模式需絕對(duì)定量時(shí)四個(gè)已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線系統(tǒng)即可自動(dòng)計(jì)算出未知樣品濃度熒光定量PCR基礎(chǔ)原理14/39陰性結(jié)果曲線圖示熒光定量PCR基礎(chǔ)原理15/39陽(yáng)性結(jié)果曲線圖示熒光定量PCR基礎(chǔ)原理16/39實(shí)時(shí)熒光定量PCR基本原理在常規(guī)PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上，加入熒光染料或熒光標(biāo)識(shí)探針，伴隨PCR反應(yīng)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物不段累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度等比增強(qiáng)。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，搜集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這么經(jīng)過(guò)熒光強(qiáng)度改變監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量改變，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。經(jīng)過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而對(duì)起始模板定量及定性分析。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理17/39熒光擴(kuò)增曲線分三階段熒光背景信號(hào)，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，平臺(tái)期熒光背景信號(hào)階段：該時(shí)期擴(kuò)增熒光信號(hào)被背景信號(hào)所掩蓋，擴(kuò)增產(chǎn)物量無(wú)法判斷。平臺(tái)期：擴(kuò)增產(chǎn)物不再呈指數(shù)增加，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量無(wú)線性關(guān)系，無(wú)法計(jì)算起始DNA拷貝數(shù)。熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段：該時(shí)期，PCR產(chǎn)物量對(duì)數(shù)值與起始模板量呈線性關(guān)系，所以選擇這一階段進(jìn)行定量分析。引入兩個(gè)概念：熒光閾值和Ct值。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理18/39實(shí)時(shí)定量PCR兩個(gè)主要概念（1）熒光域值（

threshold）：熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定一個(gè)值，以PCR反應(yīng)前15

個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，普通熒光域值定義為3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差10

倍。閾值=基線信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差x10熒光定量PCR基礎(chǔ)原理19/39實(shí)時(shí)定量PCR兩個(gè)主要概念(2)Ct值：也稱(chēng)循環(huán)閾值，C代表Cycle，t代表threshold。指在PCR循環(huán)過(guò)程中熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增加階段拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)循環(huán)次數(shù)。在實(shí)際操作中，Ct值也就是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)抵達(dá)設(shè)定域值循環(huán)次數(shù),可見(jiàn)Ct值取決于閾值。

熒光定量PCR基礎(chǔ)原理20/39基線閾值Ct值熒光定量PCR基礎(chǔ)原理21/39Ct值∝DNA起始濃度Ct值與模板DNA起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，到達(dá)熒光閾值Ct值越小。Rn=RB+X0(1+E)nRs總信號(hào)=本底信號(hào)+分子數(shù)量×單位信號(hào)強(qiáng)度Rn：第n個(gè)循環(huán)時(shí)總信號(hào)RB：本底R(shí)S：?jiǎn)挝恍盘?hào)強(qiáng)度X0：起始DNA數(shù)目E：PCR效率熒光定量PCR基礎(chǔ)原理22/39Rn=RB+X0(1+E)nRs當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=CT值時(shí)：RT=RB+X0(1+E)CTRslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs即CT=-klgX0+b（線性方程）熒光定量PCR基礎(chǔ)原理23/39定量方法利用已知起始拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)，橫坐標(biāo)代表Ct值。所以，只要取得未知樣品Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品起始拷貝數(shù)。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理24/39RealtimePCR化學(xué)原理雙鏈DNA結(jié)合染料染色-非特異性檢測(cè)–SYBR?GreenI–溴乙錠(EthidiumBromide)探針標(biāo)識(shí)-特異性檢測(cè)–TaqManTM–TaqManMGB–Dual-oligoFRETpairs–分子信標(biāo)(Molecularbeacons)–ScorpionsTM/AmplifluorTM熒光定量PCR基礎(chǔ)原理25/39SYBR

Green

I熒光染料作用原理SYBR

Green

I是一個(gè)只與雙鏈DNA小溝結(jié)合熒光染料，可與全部各種序列雙鏈DNA分子結(jié)合。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；變性時(shí)，DNA雙鏈分開(kāi)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。在延伸結(jié)束階段，采集熒光信號(hào)。所以，在一個(gè)體系內(nèi)，信號(hào)強(qiáng)度與DNA雙鏈總數(shù)目成正比其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子數(shù)量。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理26/39退火：產(chǎn)生熒光信號(hào)結(jié)合SYBRGreenI熒光定量PCR基礎(chǔ)原理27/39SYBRGreenI染料僅在與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合時(shí)發(fā)射熒光，所發(fā)射光波是藍(lán)色光。SYBRGreenI不會(huì)與單鏈DNA結(jié)合，所以變性時(shí)熒光強(qiáng)度最低。dsDNA形成單鏈（圖A）合成雙鏈（圖B）時(shí)，SYBRGreenI結(jié)合于dsDNA上，結(jié)合SYBRGreenI（綠色光）熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)。延伸末期（圖C）時(shí)，全部DNA均是雙鏈，結(jié)合狀態(tài)SYBRGreenI含量達(dá)最大，該P(yáng)CR周期中熒光信號(hào)也達(dá)最大。所以，通常是在延伸期結(jié)束時(shí)進(jìn)行SYBRGreenI熒光信號(hào)測(cè)定。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理28/39染料法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)成本低只能檢測(cè)單一模板，無(wú)法多重檢測(cè)通用性好無(wú)模板特異性，非特異性擴(kuò)張和引物二聚體也產(chǎn)生熒光適合初步篩查敏感度低，不能準(zhǔn)確測(cè)序低拷貝模板融解曲線功效，分析非特異性擴(kuò)增熒光本底高，易引發(fā)假陽(yáng)性熒光定量PCR基礎(chǔ)原理29/39熒光定量PCR基礎(chǔ)原理30/39熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）當(dāng)某個(gè)熒光基團(tuán)發(fā)射譜與另一個(gè)熒光基團(tuán)吸收光譜重合，且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量能夠從短波長(zhǎng)（高能量）熒光基團(tuán)傳遞到長(zhǎng)波長(zhǎng)（低能量）熒光基團(tuán)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，實(shí)際相當(dāng)于短波長(zhǎng)熒光基團(tuán)釋放熒光被屏蔽。Hybprobe探針和水解探針均基于FRET（熒光共振能量傳遞）原理設(shè)計(jì)。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理31/39TaqMan探針?lè)?水解探針PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物同時(shí)加入一個(gè)特異性熒光探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。TaqMan探針為一寡核苷酸，包含兩個(gè)分子標(biāo)識(shí)，探針5′端標(biāo)識(shí)有熒光匯報(bào)基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端標(biāo)識(shí)有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)，如TAMRA等。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理32/39探針完整時(shí)，匯報(bào)基團(tuán)發(fā)射熒光信號(hào)被近距離淬滅基團(tuán)吸收；伴隨PCR進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過(guò)程中碰到與模板結(jié)合探針，其5‘－3’外切酶活性將探針酶切降解，使匯報(bào)熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，游離于反應(yīng)體系中，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理33/39熒光定量PCR基礎(chǔ)原理34/39TaqMan探針數(shù)量關(guān)系每擴(kuò)增一條DNA鏈，就切斷一條探針；每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個(gè)單位熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)累積與PCR產(chǎn)物形成完全同時(shí)；信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針DNA分子數(shù)成正比，匯報(bào)信號(hào)強(qiáng)度就代表了模板DNA拷貝數(shù)。所以該技術(shù)可對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。因?yàn)閿U(kuò)增產(chǎn)物較短時(shí)效率較高，故擴(kuò)增加度普通為50—150bp。熒光定量PCR基礎(chǔ)原理35/39TaqMan探針優(yōu)點(diǎn)特異性高多重基因定量熒光強(qiáng)度正比于產(chǎn)物不可逆反應(yīng)信號(hào)生成后不會(huì)自動(dòng)淬滅熒光定量PCR基礎(chǔ)原理36/39RealtimePCR優(yōu)點(diǎn)對(duì)整個(gè)PCR實(shí)時(shí)監(jiān)控，明確了指數(shù)擴(kuò)增期，進(jìn)而可對(duì)起始模板進(jìn)行定量，且定量范圍廣；測(cè)定敏感性高，比電泳方法靈敏度高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)；測(cè)定準(zhǔn)確度和重復(fù)性好，Ct值和模板起始濃度有函數(shù)關(guān)系；大大降低試驗(yàn)室“污染”可能性