果膠酶提取銀耳多糖的研究

PAGE目錄 1 1 1 11前言 22儀器、設(shè)備和試劑 22.1材料、與設(shè)備 22.2試劑及溶液的配制 23.方法及試驗(yàn)步驟 23.1葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 23.2銀耳多糖的提取方法 33.3銀耳多糖含量的測(cè)定 44結(jié)果與分析 44.1銀耳多糖含量測(cè)定結(jié)果 44.2酶解法提取銀耳多糖結(jié)果分析 55小結(jié)與討論 6參考文獻(xiàn) 7PAGE61前言銀耳俗稱(chēng)白木耳，是一種高等真菌，屬于有隔擔(dān)子菌亞綱銀耳科。銀耳作為藥食兩用的食用菌已久負(fù)盛名。傳統(tǒng)漢方醫(yī)學(xué)認(rèn)為，它具有潤(rùn)肺生津、滋陰養(yǎng)胃、益氣和血和補(bǔ)腦強(qiáng)心等功效?，F(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究表明，銀耳中多糖物質(zhì)具有提高機(jī)體免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗?jié)?、抗血栓形成，還可增強(qiáng)機(jī)體耐缺氧能力，清除自由基，抑制腫瘤等作用。我國(guó)銀耳資源豐富，為開(kāi)發(fā)應(yīng)用銀耳多糖提供了有利條件。近年來(lái)，有關(guān)銀耳多糖的研究越來(lái)越多，但這些研究多為銀耳多糖的化學(xué)特性和藥理作用方面的研究，少有關(guān)于銀耳中提取銀耳多糖的研究。目前銀耳多糖的提取方法多為熱水浸提法或酸堿法提取，但熱水浸提法耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，且收率較底，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此不適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，而酸堿法提取雖然提取時(shí)間較短，卻會(huì)破壞銀耳多糖立體旋光活性結(jié)構(gòu)，降低甚至失去銀耳多糖的生物活性，使提取到的銀耳多糖藥用效果大大下降。因此，建立高效、經(jīng)濟(jì)的銀耳多糖提取方法是具有積極意義的。本試驗(yàn)主要研究使用果膠酶酶解銀耳，熱水提取的技術(shù)來(lái)提取銀耳多糖的方法。且如今生物工程工藝發(fā)展迅速，各種生物制品價(jià)格也不斷下降，這為用酶解法提取銀耳多糖提供了方向和可行性。用酶解法提取銀耳多糖不僅能大大縮短單純用熱水法提取的時(shí)間，也不會(huì)像酸堿法那樣破壞銀耳多糖的生物活性。因此找出最適的酶解銀耳提取銀耳多糖的條件是具有實(shí)用和良好的現(xiàn)實(shí)意義的。2儀器、設(shè)備和試劑2.1材料、與設(shè)備101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng)）YP202N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）HH系列恒溫水浴鍋（蘇州金壇中大儀器廠(chǎng)）電子萬(wàn)用爐（北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng)）TDZ5-WS型臺(tái)式低俗離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘麓離心機(jī)儀器有限公司）722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）2.2試劑及溶液的配制銀耳(市售)葡萄糖(分析純):取1g葡萄糖加入1000ml容量瓶中，定容至1000ml;果膠酶：按100ml:1g加入果膠酶苯酚（分析純）：精確量取6ml苯酚放入100ml容量瓶中，定容至100ml;濃硫酸(發(fā)煙硫酸)3.方法及試驗(yàn)步驟3.1葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作取5支潔凈的試管，分別標(biāo)記為1、2、3、4、5號(hào)管，依次加入標(biāo)準(zhǔn)糖溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和水1.0mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.2mL，再分別加入苯酚試劑1mL，濃硫酸5mL，混勻，室溫放置30min，冷卻后，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，繪制含糖量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作管號(hào)12345標(biāo)準(zhǔn)糖溶液/mL00.20.40.60.8蒸餾水/mL1.00.80.60.40.2苯酚試劑/mL1.01.01.01.01.0濃硫酸/mL5.05.05.05.05.0糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)A值測(cè)定結(jié)果管號(hào)12345糖含量/mg00.20.40.60.8A值00.2280.4250.6630.980糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=1.1975x-0.0198（糖含量為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)）方程的R2為0.992，具有較高擬合度，可以作為糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。3.2銀耳多糖的提取方法取市售銀耳適量，洗凈，70℃烘干后，破碎成粉末狀，稱(chēng)取粉末0.5g（2%），果膠酶0.25g（1%），同時(shí)加入蒸餾水25mL，迅速置于45℃水浴鍋中酶解，3個(gè)樣品為一組，第一組酶解30min，第二組酶解45min，第三組酶解60min。酶解后迅速升溫至98℃將酶滅活，然后每組樣品分別于98℃水浴中保溫浸提30min,45min,60min，浸提完成后置于冷水中冷卻至室溫，然后于4500rpm離心分離10min，最后取上清液待用。處理?xiàng)l件編號(hào)表提取時(shí)間（min）酶解時(shí)間(min)3045603012345456607893.3銀耳多糖含量的測(cè)定銀耳浸提液離心后，分別取上清液1ml,加水19ml,即稀釋20倍，取銀耳浸提稀釋液1mL于一潔凈試管中，再加入苯酚試液1.0mL，濃硫酸5mL，混勻，室溫放置30min，冷卻后，于490nm處測(cè)定吸光度。4結(jié)果與分析4.1銀耳多糖含量測(cè)定結(jié)果銀耳多糖含量A490測(cè)定結(jié)果與提取液實(shí)際糖含量結(jié)果管號(hào)A值稀釋液糖含量/mg提取液實(shí)際糖含量/mg10.3500.31154.420.4050.35177.430.4640.40202.040.3770.33165.750.4550.40198.260.5230.45226.670.3850.34169.080.4600.40200.390.5300.46229.6銀耳多糖含量結(jié)果變化圖 由上圖可知，固定酶解時(shí)間時(shí)，提高提取時(shí)間可顯著提高提取效果，改變酶解時(shí)間時(shí)，提取效果有提高，但不大，且從45min增加到60min增加不顯著。但總體提取效果與目前銀耳中提取銀耳多糖的主要工藝相比，提取效果得到了較大的提升，且比熱水直接提取法所用的時(shí)間明顯縮短，故用酶解法從銀耳中提取銀耳多糖是一種優(yōu)于傳統(tǒng)提取工藝的提取方法。4.2酶解法提取銀耳多糖結(jié)果分析由表可知，用酶解法提取銀耳多糖，不同的酶解時(shí)間和熱水浸提時(shí)間對(duì)銀耳多糖的提取率有明顯的差異。酶解時(shí)間從30到45min提取效果有增加，但從45到60min提取效果幾乎不在增加，因此可以判斷在45min左右時(shí)銀耳已酶解充分，為節(jié)約時(shí)間，增加銀耳多糖總提取效率，將酶解時(shí)間定為45min比較合適。與酶解時(shí)間相比，增加提取時(shí)間對(duì)提取效果的增加大于酶解時(shí)間的影響，且隨提取時(shí)間增加顯著提升，但在提取60min時(shí)的提取量已接近銀耳中銀耳多糖的理論含量，因此可以判斷再增加提取時(shí)間提取量的增加也不顯著，且會(huì)大大增加總提取工藝時(shí)間，影響提取工藝效率，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)銀耳多糖不利，而且長(zhǎng)時(shí)間高溫提取，也會(huì)對(duì)銀耳多糖活性產(chǎn)生影響，因此，綜合考慮，將提取時(shí)間定為60min比較合適。綜上所訴，酶解45min，熱水浸提60min的銀耳多糖提取工藝不僅有較理想的提取率，還可以盡可能的縮短提取時(shí)間，減少人力和時(shí)間的浪費(fèi)，有利于大規(guī)模生產(chǎn)銀耳多糖工業(yè)的發(fā)展。酶解時(shí)間和熱水浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響管號(hào)酶解時(shí)間/min熱水浸提時(shí)間/min多糖提取率/%1303030.92304535.53306040.44453033.15454539.66456045.37603033.88604540.19606045.95小結(jié)與討論本試驗(yàn)采用果膠酶酶解銀耳的方法提取銀耳多糖。試驗(yàn)討論了不同酶解時(shí)間與不同提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，最終確定最佳提取工藝為：在45℃下，用1%果膠酶酶解，水與銀耳比例為100ml:1g,酶解時(shí)間為45min，然后于98℃熱水浴中浸提60min。用此法提取銀耳多糖，提取率可達(dá)40%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的銀耳多糖提取工藝。相比傳統(tǒng)工藝，果膠酶提取銀耳多糖不僅有較高的提取率，還可以明顯縮短提取的時(shí)間，更有利于銀耳多糖提取大規(guī)模工業(yè)化的發(fā)展。隨著社會(huì)的發(fā)展，銀耳多糖的生物功效越來(lái)越受到人們的重視，其需求也在日益增加，故酶解法提取銀耳多糖的工藝有著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的雙重效益。銀耳多糖的生物活性在長(zhǎng)時(shí)間高溫環(huán)境和酸堿性條件下容易受到破壞，酶解法提取環(huán)境溫和，且提取時(shí)間較短，能較好的保留銀耳多糖的生物活性。雖然我國(guó)銀耳產(chǎn)量高，但銀耳仍然是有限的，酶解法能很好的保留銀耳多糖的生物活性，且提取效率很高，故該工藝條件對(duì)銀耳資源的充分利用有明顯的優(yōu)勢(shì)。參考文獻(xiàn)[1]黃文濤，胡學(xué)智.酶應(yīng)用手冊(cè)[M].上海.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1989[2]林宇野，楊虹.酶法提取銀耳多糖的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1999[3]何偉珍，吳麗仙.銀耳多糖的提取分離與純化[J].海峽藥學(xué)，2008[4]黃秀錦.銀耳多糖的提取、分離、純化及其功能性質(zhì)研究[J].食品科學(xué)，2008[5]魏國(guó)志，李國(guó)光，金梅紅.銀耳多糖的研究進(jìn)展[J].香料香精化妝品，2