第二章之微生物菌種選育

Contents菌種的來(lái)源1發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育2菌種退化和菌種保藏3微生物菌種的擴(kuò)大培育4第一節(jié)菌種的來(lái)源擔(dān)子菌細(xì)菌酵母霉菌放線菌菌種一、工業(yè)發(fā)酵常見(jiàn)微生物細(xì)菌醋酸桿菌假單胞菌乳酸菌AddYourTitle大腸桿菌枯草芽孢桿菌棒桿菌、短桿菌酵母菌釀酒酵母異樣漢遜氏酵母異樣變種假絲酵母屬AddYourTitle畢赤氏酵母屬漢遜氏酵母屬霉菌曲霉屬青霉屬根霉屬毛霉屬二、工業(yè)微生物來(lái)源source1source2source3向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取從大自然中分別篩選從發(fā)酵制品中分別三、微生物菌種的選擇性分別微生物樣品的采集微生物樣品的富集培育目的菌種的分別目的菌的篩選1234微生物樣品的采集微生物樣品的富集培育1控制培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分2控制培養(yǎng)條件3抑制不需要的菌類目的菌種的分別平板稀釋法平板劃線法平板劃線法b.連續(xù)劃線分別法分區(qū)劃線分別法1.稀釋平皿分別法平板稀釋法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀釋b.傾注平皿分別法a.涂布平皿分別法（2）倒平板用剛果紅染色法鑒定篩選降解纖維素的菌株

羧甲基纖維素鈉作培育物抗生素篩選檢定菌培育，加上發(fā)酵液目的菌的篩選影印平板法篩選目的菌四、重要工業(yè)微生物菌種的分別篩選菌株的一些重要指標(biāo)：（1）菌的養(yǎng)分特征（2）菌的生長(zhǎng)溫度（3）菌對(duì)所接受的設(shè)備和生產(chǎn)過(guò)程的適應(yīng)性（4）菌的穩(wěn)定性（5）菌的產(chǎn)物得率和產(chǎn)物在培育液中的濃度（6）簡(jiǎn)潔從培育液中回收產(chǎn)物。生產(chǎn)性能抗生素產(chǎn)生菌的篩選Text抗生素產(chǎn)生菌的篩選抑菌圈法稀釋法生物自顯影法擴(kuò)散法抑菌圈法生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的篩選產(chǎn)生藥理活性化合物菌株的篩選多糖產(chǎn)生菌的篩選自然選育誘變育種雜交育種基因工程育種原生質(zhì)體融合其次節(jié)發(fā)酵高產(chǎn)菌種的選育菌種改良物理化學(xué)生物遺傳基因一、自然選育自然選育在生產(chǎn)過(guò)程中，不經(jīng)過(guò)人工處理，利用菌種的自發(fā)突變，選育出優(yōu)良菌種的過(guò)程。誘變育種誘變育種是利用物理或化學(xué)誘變劑處理勻整分散的微生物細(xì)胞群，促進(jìn)其突變率大幅度提高，然后接受簡(jiǎn)便、快速和高效的篩選方法，從中選擇少數(shù)符合育種目的的突變株，以供生產(chǎn)實(shí)踐或科學(xué)探討用。誘變育種的原理誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變生物誘變劑化學(xué)誘變劑物理誘變劑紫外線快中子NTGNM噬菌體轉(zhuǎn)座子超凈工作臺(tái)小型X射線衍射儀Co60射線機(jī)誘變育種的一般步驟保誘變篩選放大罐試驗(yàn)，中試考查大型投產(chǎn)誘變育種步驟動(dòng)身菌株的選擇制備菌懸液誘變處理突變菌株的篩選(一)動(dòng)身菌株的選擇1．自然界新分別的野生型菌株，對(duì)誘變處理較敏感，簡(jiǎn)潔達(dá)到好的效果。2．在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的動(dòng)身菌株。3．每次誘變處理都有確定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4．動(dòng)身菌株起先時(shí)可以同時(shí)選2～3株，在處理比較后，將更適合的動(dòng)身菌株留作接著誘變。5．要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來(lái)作動(dòng)身誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特殊是高產(chǎn)基因。

(二)處理菌懸液的制備這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進(jìn)行合適培育基的培育，并要離心，洗滌，過(guò)濾。帶玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi),加無(wú)菌水(三)誘變處理依據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對(duì)象的實(shí)際，設(shè)計(jì)誘變處理方案。(四)突變菌株的篩選篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以快速篩出大量的達(dá)到初步要求的分別菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異。

1)養(yǎng)分缺陷型的選育養(yǎng)分缺陷型是指通過(guò)誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些養(yǎng)分物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的實(shí)力，必需在其基本培育基中加入相應(yīng)的養(yǎng)分成分才能正常生長(zhǎng)的變異株。與養(yǎng)分缺陷型對(duì)應(yīng)的是野生型。與篩選養(yǎng)分缺陷型有關(guān)的三類培育基：①基本培育基（MM，minimalmedium）——能滿足某一菌種的野生型菌株養(yǎng)分要求的最低成分的合成培育基。②補(bǔ)充培育基（SM，supplementalmedium）——在基本培育基中有針對(duì)性地補(bǔ)加某一種或幾種養(yǎng)分成分，以滿足相應(yīng)的養(yǎng)分缺陷型菌株生長(zhǎng)須要（其他養(yǎng)分缺陷型仍不能生長(zhǎng)）的培育基。③完全培育基（CM，completemedium）——可滿足該菌各種養(yǎng)分缺陷型菌株養(yǎng)分須要的自然或半合成培育基。篩選養(yǎng)分缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長(zhǎng)譜一、誘變方法物理誘變化學(xué)誘變二、淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生長(zhǎng)，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培育短時(shí)讓野生型生長(zhǎng)，處于活化階段，而缺陷型無(wú)法生長(zhǎng)，仍處于休眠狀態(tài)。由于細(xì)菌或酵母對(duì)一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入確定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細(xì)菌可以接受青霉素，酵母可接受制霉菌素。菌絲過(guò)濾法：對(duì)于霉菌，因孢子生長(zhǎng)后會(huì)長(zhǎng)出菌絲體，就可用濾紙過(guò)濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過(guò)。

三、檢出缺陷型原理：利用不同菌株在固體基本培育基（MM）和完全培育基（CM）上，生長(zhǎng)狀況完全不同的特點(diǎn)。缺陷型菌株在CM上生長(zhǎng)良好，而在MM上則不生長(zhǎng)，而野生型都能生長(zhǎng)。具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法

(一)影印法此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有確定間隔。

(二)點(diǎn)種法也就是隨意法。用接種針或牙簽將CM上長(zhǎng)出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種，然后一起培育，視察其生長(zhǎng)狀況。此法結(jié)果明確，但工作量大。

(三)夾層法先在培育皿上倒一層基本瓊脂培育基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培育基，培育24h，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上一層CM瓊脂培育基，再培育。這時(shí)其次批長(zhǎng)出的菌落就可能是缺陷型。此法缺點(diǎn)是，結(jié)果有時(shí)不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很簡(jiǎn)潔。四、養(yǎng)分缺陷型的鑒定驗(yàn)證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長(zhǎng)譜測(cè)定。（1）氨基酸、維生素、核酸堿基三大類養(yǎng)分缺陷的鑒定abcabcabca-氨基酸混合液b-維生素混合液c-核酸水解液（2）單一氨基酸養(yǎng)分缺陷的確定將缺陷型菌株培育后，收集菌體，制備成細(xì)胞懸液，與MM培育基(溶化并涼至50℃)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的6個(gè)區(qū)間放上不同的養(yǎng)分組合的混合物或吸飽此組合養(yǎng)分物的濾紙圓片。培育后會(huì)在某組合區(qū)長(zhǎng)出，就可測(cè)得所需養(yǎng)分?！獋€(gè)平皿測(cè)一個(gè)菌。原理：抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种仆蛔冎甓际怯捎诖x失調(diào)所造成的，在細(xì)胞中已經(jīng)有大量最終代謝產(chǎn)物時(shí)仍舊接著不斷地合成這一產(chǎn)物。方法：選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株結(jié)構(gòu)類似物是指一些和微生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相類似的物質(zhì)，因而能夠引起反饋，但是它們不能參與生物合成。目的：主要用于末端產(chǎn)物的積累2）抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种仆蛔冎甑暮Y選在培育基中添加末端產(chǎn)物類似物后，未突變的細(xì)胞將由于代謝途徑受阻而不能獲得生物合成所需的該種末端產(chǎn)物，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。那些對(duì)類似物不敏感的突變體，則由于原來(lái)受反饋限制的酶的結(jié)構(gòu)，或是酶的合成系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)生了變更，它們不再受抑制或阻遏的影響，在類似物充斥的狀況下照常能合成該種末端產(chǎn)物。例如，用類似物D-精氨酸選出的谷氨酸棒桿菌的抗反饋突變株可使L-精氨酸的產(chǎn)量得到提高。3）抗性突變菌株的篩選抗生素抗性突變株在抗生素產(chǎn)生菌選育中，通過(guò)篩選抗生素抗性突變可提高抗生素產(chǎn)量?？股乜剐酝蛔冎瓿芴岣呖股氐漠a(chǎn)量外，還能提高其它代謝產(chǎn)物的量。條件抗性突變因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為"野生型"菌株的特性和突變型菌株特性的突變稱為條件抗性突變或稱為條件致死突變。溫度敏感突變常用于提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量致死養(yǎng)分缺陷抗性突變菌株的篩選方法一次性篩選法一次性篩選法就是指在對(duì)動(dòng)身菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選出少量抗性變異株。噬菌體抗性菌株耐高溫菌株階梯性篩選法

梯度平板法

基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程三、雜交育種標(biāo)記標(biāo)記親和力親和力A+B+C-D-A-B-C+D+A+B+C+D+接合兩株E.coli的接合電鏡照片DNA的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)準(zhǔn)性生殖四、原生質(zhì)體融合通過(guò)人工方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生重組子的過(guò)程。原生質(zhì)體的重組頻率已大于1/10，而誘變育種一般僅為百萬(wàn)分之一。五、基因工程育種第三節(jié)菌種的退化和菌種的保藏菌種退化1微生物菌種保藏2一、菌種退化是指在較長(zhǎng)時(shí)期傳代保藏后，菌株的一個(gè)或多個(gè)生理性狀和形態(tài)特征漸漸減退或消逝的現(xiàn)象。（一）引起菌種退化的緣由基因突變連續(xù)傳代其他因素（二）菌種的復(fù)壯使衰退的菌種復(fù)原原來(lái)優(yōu)良性狀。狹義的復(fù)壯是指在菌種已發(fā)生衰退的狀況下，通過(guò)純種分別和生產(chǎn)性能測(cè)定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個(gè)體，以達(dá)到復(fù)原該菌原有典型性狀的措施；廣義的復(fù)壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識(shí)的常常、進(jìn)行純種的分別和生產(chǎn)性能測(cè)定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。菌種的復(fù)壯措施①純種分別：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細(xì)胞挑取法等）。

②通過(guò)寄主體內(nèi)生進(jìn)步行復(fù)壯（如Bacillusthuringiensis的復(fù)壯）；

③淘汰已衰退的個(gè)體（接受比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個(gè)體）。

④接受有效的菌種保藏方法。1）合理的育種；

2）限制傳代次數(shù)（一般在DNA的復(fù)制過(guò)程中，堿基的錯(cuò)配率是5x10-4，自發(fā)突變的頻率為10-8~10-9，接受良好的菌種保藏方法，可以削減移種和傳代的數(shù)）；

3）選擇合適的培育條件；

4）接受不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代（對(duì)絲狀微生物而言，通常接受穩(wěn)定的單核孢子進(jìn)行接種）；

5）接受有效的菌種保藏方法。（三）防止菌種衰退的方法1.目的：

①存活，不丟失，不污染

②防止優(yōu)良性狀丟失

③隨時(shí)為生產(chǎn)、科研供應(yīng)優(yōu)良菌種

2.原理：選用優(yōu)良的純種，（最好是休眠體，如分生孢子、芽胞等），創(chuàng)建降低微生物代謝活動(dòng)強(qiáng)度，生長(zhǎng)繁殖受抑制，難以發(fā)生突變的環(huán)境條件。（其環(huán)境要素是干燥、低溫、缺氧、缺養(yǎng)分以及添加愛(ài)護(hù)劑等）。二、菌種保藏菌連續(xù)在培育基上（內(nèi)）移種種生活態(tài)傳代培育保藏法連續(xù)在活宿主上（內(nèi)）移種保固體斜面藏濕法半固體瓊脂柱方休眠態(tài)液體介質(zhì)（蒸餾水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管內(nèi)吸附在合適的載體上3.菌種保藏的方法①低溫保藏法

方法：菌種管置4℃冰箱保藏，定時(shí)傳代

原理：低溫下，微生物代謝強(qiáng)度明顯下降。

②石蠟油低溫保藏法：

橡皮塞取代棉塞、加石蠟油。③干燥保藏法將菌種置于土壤、細(xì)紗、濾紙、硅膠等干燥材料上保藏。如砂土管法，適用于放線菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏時(shí)間幾至幾十年。④真空冷凍干燥法加有愛(ài)護(hù)劑的菌懸液在凍結(jié)狀態(tài)下予以真空干燥。適用于各種微生物，便于大量保藏，菌種存活時(shí)間長(zhǎng)，是目前最好的保藏方法。⑤液氮超低溫保藏法將菌種置于