病原生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教材 實(shí)驗(yàn)四NK2014冬,20141229(407)教學(xué)課件

實(shí)驗(yàn)四MTT比色法檢測(cè)小鼠脾臟NK細(xì)胞活性（MTT比色法檢測(cè)小鼠脾臟NK細(xì)胞活性）原理：1.制備小鼠脾細(xì)胞（含NK細(xì)胞）2.NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞（YAC-1）共孵育，NK活性越強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞被殺死越多。3.MTT底物可被活細(xì)胞線(xiàn)粒體的琥珀酸脫氫酶還原成藍(lán)紫色產(chǎn)物，死細(xì)胞無(wú)此功能；活細(xì)胞越多，顏色越深；據(jù)此推斷活細(xì)胞或死細(xì)胞多少。4.經(jīng)酶標(biāo)儀比色后，可計(jì)算出NK細(xì)胞活性。主要方法：（一）免疫細(xì)胞（小鼠脾NK細(xì)胞）的制備（二）NK細(xì)胞活性測(cè)定（MTT比色法）MTT比色法檢測(cè)小鼠脾臟NK細(xì)胞活性[方法]：1、靶細(xì)胞制備YAC-1細(xì)胞，洗滌，計(jì)數(shù)，調(diào)整至2×105/ml（已制備好，用前搖勻）2、效應(yīng)細(xì)胞（脾NK細(xì)胞）制備處死小鼠，消毒取脾，制成脾細(xì)胞懸液，過(guò)濾，離心洗滌，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/ml。（具體操作如下）2、效應(yīng)細(xì)胞（脾NK細(xì)胞）制備（1）脫頸椎處死小鼠，放入中號(hào)平皿；（2）酒精棉球消毒，無(wú)菌取出脾臟，放入小平皿；（3）脾臟用Hanks液沖洗一次；（4）輕輕拉碎脾臟，并懸浮于約3mlHanks液中；稍?xún)A斜靜置5分鐘，使大塊組織沉降；（5）吸上清過(guò)120目或200目濾網(wǎng)，濾液濾入試管；（6）濾液1500轉(zhuǎn)/min離心5min，倒去上清；

（7）脾細(xì)胞沉淀用Hanks液洗2次（加入3mlHanks液，混勻，1500r/min，離心5min，倒去上清；重復(fù)上述步驟1次）；（8）用1ml1640培養(yǎng)液溶解脾細(xì)胞沉淀，混勻，配成脾細(xì)胞懸液（原液），計(jì)數(shù)（吸取10ul加入390ul白細(xì)胞稀釋液中，稀釋40倍，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)），根據(jù)P53頁(yè)公式計(jì)算脾細(xì)胞懸液原液中脾細(xì)胞濃度；（9）吸取一定量脾細(xì)胞懸液原液，用1640培養(yǎng)液配制2×106/ml濃度的脾細(xì)胞懸液1毫升至2毫升，待用。3、細(xì)胞毒試驗(yàn)按表7-3加樣，

4、孵育二氧化碳培養(yǎng)箱孵育2小時(shí)；加MTT，繼續(xù)孵育2小時(shí)。5、測(cè)OD值輕輕吸棄上清，加二甲亞砜150ul，振蕩10min，測(cè)OD值。6、結(jié)果分析

表7-3MTT法測(cè)NK細(xì)胞活性試驗(yàn)各組成分(3復(fù)孔/組)實(shí)驗(yàn)組靶細(xì)胞對(duì)照組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組空白對(duì)照靶細(xì)胞100ul100ul————效應(yīng)細(xì)胞100ul——100ul——1640培養(yǎng)基——100ul100ul200ul（1-實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值靶細(xì)胞對(duì)照組OD值）×100%NK細(xì)胞活性（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值靶細(xì)胞對(duì)照組OD值）×100%NK細(xì)胞活性（%）=附：