ET同源重組技術(shù)主要內(nèi)容與運(yùn)用,生物技術(shù)論文

Red/ET同源重組技術(shù)主要內(nèi)容與運(yùn)用,生物技術(shù)論文2001年人類基因組測(cè)序完成，基因中所含有的大量的功能信息越來越遭到人們的關(guān)注。為了解這些復(fù)雜的人類密碼的含義，對(duì)單個(gè)基因功能的研究也顯得越來越重要。然而，對(duì)于真核生物基因片段而言，其序列中除了包含具有功能、能表示出的外顯子之外，還含有很多調(diào)控序列等內(nèi)含子，如此一個(gè)基因片段則可能大至幾十或上百Kb.固然現(xiàn)今有相應(yīng)的載體，如BAC〔人工染色體〕和PAC〔P1人工染色體〕能裝載如此大量的基因信息，但是要找到這些基因片段的限制性內(nèi)切位點(diǎn)，并在體外對(duì)其進(jìn)行長(zhǎng)距離的片段擴(kuò)增的難度比擬大[1、2].Red/ET重組技術(shù)是以傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)為基礎(chǔ)，但是，相對(duì)于普通的同源重組技術(shù)而言，它具有簡(jiǎn)單、快速、高效等特點(diǎn)，而且整個(gè)重組經(jīng)過不需要經(jīng)過體外擴(kuò)增階段，這樣能夠避免外界環(huán)境引起的不必要的突變。1傳統(tǒng)同源重組自然發(fā)生的同源重組是兩個(gè)DNA分子之間進(jìn)行片段交換，進(jìn)而使序列重排。1956年，在大腸桿菌中，AJohnClark發(fā)現(xiàn)了兩種與同源重組有關(guān)的酶，RacA和RecBCD.在同源重組發(fā)生的時(shí)候，RecA結(jié)合DNA單鏈或雙鏈，對(duì)雙鏈DNA進(jìn)攻，把原來配對(duì)的互補(bǔ)鏈分開，并嘗試本身與被入侵DNA鏈配對(duì)。當(dāng)配對(duì)成功后，RecA蛋白脫落?；蛘咴赗ecBCD的引導(dǎo)下，使目的DNA解旋，以便使外源DNA分子插入并在RecA的幫助下進(jìn)行重組。當(dāng)兩條鏈發(fā)生重組時(shí)，會(huì)產(chǎn)生holliday中間體，該中間體在重組完成時(shí)由RuvAB和RecG蛋白進(jìn)行拆分。至此，構(gòu)成兩條含有異源序列的雙鏈DNA.在質(zhì)?；蚴删w轉(zhuǎn)入大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)同源區(qū)段小于75bp時(shí)會(huì)使重組率顯著降低。但是實(shí)際上，在RecA重組系統(tǒng)中，要求同源臂的長(zhǎng)度在1kb左右，且反響條件要求比擬苛刻。2Red/ET同源重組技術(shù)Red/ET同源重組系統(tǒng)，其實(shí)是Red同源重組系統(tǒng)和ET同源重組系統(tǒng)的總稱，華而不實(shí)ET系統(tǒng)于1998年由Stewart等在大腸桿菌中誘導(dǎo)的Rac噬菌體中發(fā)現(xiàn)，隨后又在噬菌體中發(fā)現(xiàn)了Red系統(tǒng)。在這兩個(gè)系統(tǒng)中，整個(gè)重組經(jīng)過由DNA重組酶介入而不需要限制性內(nèi)切酶，且對(duì)同源臂長(zhǎng)度的要求低，僅需35-50bp的同源序列，而傳統(tǒng)的RecA同源重組則需要大約1kb的同源序列。并且該系統(tǒng)介導(dǎo)的整個(gè)同源重組經(jīng)過都是在細(xì)內(nèi)進(jìn)行，避免了因胞外反響引起的不必要突變。2.1ET同源重組系統(tǒng)該系統(tǒng)于1998年由Stewart等在大腸桿菌中誘導(dǎo)的Rac噬菌體中發(fā)現(xiàn)，其所需的單側(cè)同源臂長(zhǎng)度僅為35-50bp,該噬菌體通過表示出蛋白R(shí)ecE和RecT來介導(dǎo)重組反響。華而不實(shí)RecE蛋白有5-3外切酶活性，能夠從5-3端依次切下雙鏈DNA上的堿基，使DNA分子構(gòu)成3粘性末端。RecT是一種單鏈結(jié)合蛋白，保衛(wèi)單鏈核苷酸不被降解，能在退火時(shí)指導(dǎo)單鏈入侵。在ET系統(tǒng)中，帶有同源臂的外援DNA分子能夠直接通過同源臂找到同源區(qū)域，然后進(jìn)行DNA的互換。2.2Red同源重組系統(tǒng)Red重組系統(tǒng)也是由Stewart的實(shí)驗(yàn)小組在噬菌體中發(fā)現(xiàn)，它是由Red和Red兩種蛋白組成的同源重組系統(tǒng)。Red由三個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成，中間的空隙能消化DNA分子，與ET系統(tǒng)中的RecE蛋白類似，它具有5-3端核酸外切酶活性，能構(gòu)成3粘性末端。Red也是一種單鏈結(jié)合蛋白，作用類似于ET系統(tǒng)中的RecT蛋白。3重組原理及操作3.1Red/ET同源重組的原理根據(jù)Red/ET中Red及RecE、Red及RecT的功能，揣測(cè)了該同源重組系統(tǒng)的作用機(jī)理。當(dāng)帶有同源臂的外源DNA分子進(jìn)入到大腸桿菌中時(shí)，Red或RecE發(fā)揮其5-3端核酸外切酶功能，由5端開場(chǎng)降解DNA序列，產(chǎn)生的3粘性末端，這時(shí)外源DNA具備了與受體DNA發(fā)生重組的條件。產(chǎn)生的粘性末端被RecT或者Red結(jié)合35bp的單鏈核苷酸序列，同時(shí)防止被細(xì)胞內(nèi)存在的核酸內(nèi)切酶降解[i].在DNA退火時(shí)，含有粘性末端的3單鏈進(jìn)攻雙鏈DNA片段，重組。發(fā)生重組的兩條DNA鏈經(jīng)過剪切和DNA聚合酶的修復(fù)作用后，重組DNA構(gòu)成，外源DNA成功導(dǎo)入受體DNA中[3].3.2操作方式該重組技術(shù)在的操作方式主要有兩種?！?〕建立含有將基因的ET系統(tǒng)或Red系統(tǒng)的質(zhì)粒，在施行重組時(shí)將三者共同導(dǎo)入受體分子中，共同表示出?！?〕直接在受體菌中挑選出能進(jìn)行Red/ET重組的菌株。前者的重組成功率更高層次，但是當(dāng)受體分子不容易接受外源DNA時(shí)，后一種方式就顯得愈加便捷。4系統(tǒng)優(yōu)化最初Red/RT系統(tǒng)采用的是pDAB-ET依托型質(zhì)粒載體，在該載體中，recE、recT以及基因分放在PBAD、EM7和Tn-5啟動(dòng)子下共表示出。在之后構(gòu)建的pDAB-ETg和pDAB-gba載體中，RecE/RecT/Red和Red/Red/Red被放在PBAD啟動(dòng)子后面共表示出，該啟動(dòng)子受L-阿拉伯糖誘導(dǎo)調(diào)控。但是在實(shí)際應(yīng)用經(jīng)過中卻發(fā)現(xiàn)了一些問題。首先，在發(fā)生重組后該載體不容易從宿主細(xì)胞中去除，影響后續(xù)的研究工作。為此，研究人員開發(fā)了溫控性質(zhì)粒。其原理是將Red/Red與基因放在含有PL啟動(dòng)子和cI857基因的載體上，然后導(dǎo)入大腸桿菌中表示出。在溫度為30℃時(shí)，cI857基因啟動(dòng)PL啟動(dòng)子，使Red系統(tǒng)不表示出。當(dāng)溫度為42℃時(shí)，cI857基因的作用被抑制，Red系統(tǒng)得以重新表示出。其次，由于工程用大腸桿菌一般都缺乏RecA蛋白，在這樣的情況下重組的發(fā)生率會(huì)降低。在最初的目的中使RecA缺失，其目的是為了讓真?zhèn)€表示出系統(tǒng)中外源DNA復(fù)制更穩(wěn)定。但是為了避免RecA缺失對(duì)重組率的影響又從新引入了RecA蛋白[3].再次，基因在表示出的經(jīng)過中不易控制，它的過度表示出會(huì)影響RecBCD的活性，進(jìn)而影響質(zhì)粒表示出的穩(wěn)定性〔Gam蛋白與RecBCD蛋白結(jié)合只是抑制了RecBCD對(duì)核酸的降解能力，但仍然能對(duì)同源重組起促進(jìn)作用〕。為了解決這樣的問題，研究者將基因和Red/ET系統(tǒng)共表示出，進(jìn)而對(duì)基因進(jìn)行調(diào)控。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)，基因上的5端的非翻譯區(qū)域?qū)χ亟M效率有很大的影響。將含有5端的非翻譯區(qū)突變的基因與Red和Red連接，能夠很大程度的提高重組效率。5在載體構(gòu)建中的應(yīng)用2006年Osterrieder[ii]等運(yùn)用Red/ET系統(tǒng)和反挑選系統(tǒng)〔I-SceI蛋白〕設(shè)計(jì)出了兩步重組方式方法。首先設(shè)計(jì)一個(gè)含有I-SceI同源臂的基因片段，通過Red/ET系統(tǒng)轉(zhuǎn)入載體之中。構(gòu)建好的重組載體通過誘導(dǎo)I-SceI蛋白的表示出，使雙鏈產(chǎn)生切口。切口處可作為同源臂，進(jìn)行下一次的異源重組。這種兩步重組系統(tǒng)大大的提高了重組的精到準(zhǔn)確性。在對(duì)致病菌基因的研究中，朱善元等對(duì)禽致病大腸桿菌的ibeA基因進(jìn)行缺失，用缺失該基因的大腸桿菌粘附與侵襲人微血管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果顯示，缺失ibeA基因的大腸桿菌與微血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力顯著下降，侵襲率也顯著下降[4].Murphy等還通過該技術(shù)對(duì)致病大腸桿菌的有毒基因進(jìn)行敲除，以為免疫制劑的進(jìn)一步研究提供理論方式方法[5].蘭德松等，利用Red/ET同源重組技術(shù)，通過兩步重組法構(gòu)建了禽流感A/Goose/Guangdong/3/96〔H5N1〕毒株的血凝素〔HA〕基因的重組火雞皰疹病毒。他們的研究為新型禽流感重載活性疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)[6].6瞻望Red/ET同源重組技術(shù)的使用，為外源基基因的重組表示出提供了一種快速、簡(jiǎn)單的方式方法。在抗生素的開發(fā)中，使抗生素異源表示出，提高產(chǎn)量也是研究中的重點(diǎn)。該技術(shù)除了能方便的運(yùn)用于抗生素的異源表示出方面，還能夠通過對(duì)基因簇的修飾、重排、刪除等來創(chuàng)造新的抗生素。如今已有該方面的研究。以下為參考文獻(xiàn)[1]ZhaoS.AComprehensiveBACResource[J].NucleicAcidsResearch,2001,29〔1〕：141-143.[2]馬先勇，姚開泰。同源重組技術(shù)研究進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展，1996,16〔3〕：16-23.[3]王軍平，張友明。Red/ET重組及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào)，2000,18〔12〕：502-506[4]朱善元，王健，左偉勇等。禽致病性大腸桿菌ibeA基因缺失及特征分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2018,29〔12〕：1578-1581.[5]MurphyKC,CampelloneKG,,etal.LambdaRed-MediatedRecombinologeni