雙熒光素酶系統(tǒng)實驗操作步驟及方法

雙熒光素酶系統(tǒng)實驗操作步驟及方法第1頁/共15頁雙熒光素酶報告系統(tǒng)第2頁/共15頁報告基因(reportergene):是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，也就是說，是一個其表達產物非常容易被鑒定的基因。一般的，把報告基因的編碼序列和基因表達調節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控。在動物基因表達調控的研究中，報告基因被廣泛應用。如綠色熒光蛋白(GFP）和熒光素酶。一、概述第3頁/共15頁熒光素酶（Luciferase）：是能夠催化不同底物氧化發(fā)光的一類酶的統(tǒng)稱，哺乳細胞無內源性熒光素酶。熒光素酶報告基因的優(yōu)點蛋白不需要翻譯后加工，所以一旦翻譯立即產生報告活性。在所有的化學發(fā)光反應中，它的光產物具有最高的量子效率，因而非常靈敏。另外，在宿主細胞及檢測試劑中均檢測不到背景發(fā)光。檢測快速，每個樣品只需幾秒鐘。第4頁/共15頁

構建成熒光素酶報告質粒。然后轉染細胞，適當刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調控元件的影響。二、實驗原理

利用熒光素酶與底物結合發(fā)生化學發(fā)光反應的特性，把感興趣的基因轉錄的調控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（fireflyluciferase）的上游，LUC

啟動子細胞內目的基因的轉錄被激活未處理對照刺激物處理啟動子-Luc轉染細胞啟動子-Luc的啟動子被激活Luc的轉錄Luc表達量測得的熒光值第5頁/共15頁同時，為了減少內在的變化因素（如：培養(yǎng)細胞的數(shù)目和活力的差別，細胞轉染和裂解的效率等）對實驗準確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinillaluciferase）的質粒（phRL-TK）作為對照質粒與報告基因質粒共轉染細胞，提供轉錄活力的內對照，使測試結果不受實驗條件變化的干擾。在測量過程中，當加入熒光素酶檢測試劑II(LARII)時產生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶報告基因。定量螢火蟲熒光強度之后，再在同一樣品中加入Stop&Glo?試劑，將上述反應淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應，同時進行第二次測量。第6頁/共15頁A．檢測前相關試劑配制

1.1XPLB裂解緩沖液配制：將4×體積水或PBS加入1×體積5XPLB裂解緩沖液。（使用前在室溫平衡1X緩沖液，平衡需2-3min）。

2.LuciferaseAssayReagentII(LARII)配制：將LuciferaseAssayBufferII加入LuciferaseAssaySubstrate充分混合后，分裝，置于-20℃避光保存。（一次配好，分裝成小管，避免反復凍融），使用前將配好的LARII從-20℃拿出，并平衡至室溫（需20-30min）。三、操作程序與結果判定第7頁/共15頁3.Stop&Glo?Reagent配制：現(xiàn)用現(xiàn)配，先將Stop&Glo?Buffer放在37度溫箱中平衡至室溫（15-30min），再將1倍體積的50XStop&Glo?Substrate加入49倍體積的將Stop&Glo?Buffer中。第8頁/共15頁B．樣品制備1.仔細地將生長培養(yǎng)基從待檢細胞孔中吸出。用1XPBS漂洗細胞2-3次。此過程必須仔細，并盡量將漂洗用PBS吸盡（防止細胞掉落）。2.24孔板每孔加入100-150μl1X裂解緩沖液PLB以覆蓋細胞。然后將24孔板置搖床振搖20-30min以保證裂解緩沖液完全裂解細胞。第9頁/共15頁C．雙熒光素酶檢測（PromegaGLOMAX）(注：系統(tǒng)運行時請勿觸摸操作屏)1.重新設定系統(tǒng)：ToolsSettingsReset2.雙熒光素酶檢測程序的設定：

ProtocolsRunPromegaProtocolDLR-O-INJOK3.將50μlLARII加入1.5mlEP管中（專用的進口EP管），取10μl細胞裂解液加入裝有LARII的1.5mlEP管中，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出氣泡），置于檢測儀，點擊“Measure”開始讀數(shù)（為螢火蟲熒光素酶反應強度）。（使用前LARII要混勻，并平衡到室溫）第10頁/共15頁4.測量結束后，取出EP管，再加入50μlStop&Glo?Reagent，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出氣泡），再次置于檢測儀，點擊“Measure”開始讀數(shù)（為內參海腎熒光素酶反應強度）。（Stop&Glo?Reagent現(xiàn)配現(xiàn)用，不能保存）5.記錄讀數(shù):每個樣品會有3個數(shù)值：RLU1——螢火蟲熒光素酶反應強度,RLU2——內參海腎熒光素酶反應強度,Ratio——RLU1/RLU2。一般記錄Ratio值即可，但RLU1和RLU2為實際熒光強度值，可以反映細胞的轉染效率，也可根據(jù)實際熒光強度來調整報告質粒與內參的比例。第11頁/共15頁6.測量完畢后，請將最后檢測的EP管取出后，關閉儀器。7.實驗結果的處理與分析：采用雙樣本等方差t檢驗進行處理，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。第12頁/共15頁四、注意事項由于溫度對酶反應有影響，所以測定時樣品和試劑均需達到室溫后再進行測定。Renilla熒光素酶檢測工作液后需配制后立即使用，不可配制成工作液后長期保存。LuciferaseAssayReagentII(LARII)不能反復凍融，保證每次用同一批次的LARII。配好的LARII在-20度可穩(wěn)定一個月，在-70度可穩(wěn)定一年。第13頁/共15頁試劑保存和