病毒與細(xì)胞的相互作用演示文稿

病毒與細(xì)胞的相互作用演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共51頁(yè)。優(yōu)選病毒與細(xì)胞的相互作用當(dāng)前2頁(yè)，總共51頁(yè)。目的要求：1、掌握病毒的細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)和方法以及病毒與細(xì)胞的相互作用機(jī)制。

2、了解病毒持續(xù)性感染的機(jī)制和干擾素的產(chǎn)生和作用機(jī)理。

重點(diǎn)：病毒的細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)、方法和病毒與細(xì)胞的相互作用機(jī)理

難點(diǎn)：病毒與細(xì)胞的相互作用機(jī)理和病毒持續(xù)性感染的機(jī)制和干擾素的產(chǎn)生和作用機(jī)理當(dāng)前3頁(yè)，總共51頁(yè)。第一節(jié)病毒的細(xì)胞培養(yǎng)病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，培養(yǎng)病毒必須使用細(xì)胞。根據(jù)病毒的不同選用敏感動(dòng)物（動(dòng)物接種）、雞胚（雞胚接種）或離體細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)（細(xì)胞培養(yǎng)）。當(dāng)前4頁(yè)，總共51頁(yè)。一、動(dòng)物接種接種后通常以動(dòng)物發(fā)病、死亡作為感染的指標(biāo)。按病毒侵襲部位不同選擇適當(dāng)?shù)慕臃N途徑。嗜神經(jīng)病毒接種在小鼠的腦內(nèi)。痘苗病毒和單純皰疹病毒接種于家兔角膜。當(dāng)前5頁(yè)，總共51頁(yè)。動(dòng)物接種的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：⑴不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備；⑵技術(shù)簡(jiǎn)單；⑶易成功缺點(diǎn)：⑴個(gè)體差異大⑵價(jià)格昂貴⑶數(shù)量有限⑷需要隔離畜舍當(dāng)前6頁(yè)，總共51頁(yè)。二、雞胚接種一種比較經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的方法。當(dāng)前7頁(yè)，總共51頁(yè)。當(dāng)前8頁(yè)，總共51頁(yè)。雞胚接種的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)簡(jiǎn)單、來(lái)源充沛、價(jià)格低廉、數(shù)量可大，不需特殊設(shè)備缺點(diǎn)：很多病毒不能適應(yīng)，主要是哺乳動(dòng)物的病毒。當(dāng)前9頁(yè)，總共51頁(yè)。三、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)是指利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使動(dòng)物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至2～4個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)前10頁(yè)，總共51頁(yè)。(一)細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：每個(gè)細(xì)胞生理特性基本一致，對(duì)病毒易感性相等無(wú)個(gè)體差異，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作細(xì)胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長(zhǎng)特征應(yīng)用空斑技術(shù)可進(jìn)行病毒的克隆化當(dāng)前11頁(yè)，總共51頁(yè)。（二）細(xì)胞的類型根據(jù)細(xì)胞來(lái)源、染色體特征及傳代次數(shù)，可分為三種類型：1.原代細(xì)胞(primarycell)：動(dòng)物組織經(jīng)胰蛋白酶消化處理，使細(xì)胞分散而獲得的單個(gè)細(xì)胞，再生長(zhǎng)于培養(yǎng)器皿中。大多數(shù)組織均可制備原代細(xì)胞，但生長(zhǎng)的快慢及難易程度不一。當(dāng)前12頁(yè)，總共51頁(yè)。（二）細(xì)胞的類型2.二倍體細(xì)胞(diploidcellstrain)：將長(zhǎng)成單層的原代細(xì)胞消化分散成單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣，保持其二倍染色體數(shù)目的細(xì)胞，稱為二倍體細(xì)胞。但巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等體外培養(yǎng)時(shí)一般不分裂，很難獲得二倍體細(xì)胞株。當(dāng)前13頁(yè)，總共51頁(yè)。（二）細(xì)胞的類型3.傳代細(xì)胞系(diploidcellline)：能在體外持續(xù)增殖傳代的細(xì)胞，大多數(shù)由癌細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突變而成，染色體數(shù)目不正常，為異倍體。優(yōu)點(diǎn)：傳代及培養(yǎng)方便缺點(diǎn)：對(duì)有的分離野毒（樣本中的病毒）不敏感由于擔(dān)心致腫瘤的潛在危險(xiǎn)，傳代細(xì)胞一般不能用于制備疫苗。常用傳代細(xì)胞系：HeLe(人子宮癌細(xì)胞)，Vero(非洲綠猴腎細(xì)胞)，BHK21(乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)，PK15(豬腎細(xì)胞)等當(dāng)前14頁(yè)，總共51頁(yè)。（三）細(xì)胞培養(yǎng)的方法常用的有靜置培養(yǎng)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)兩種1.靜置培養(yǎng)(stationaryculture)：實(shí)驗(yàn)室常用。將消化分散的細(xì)胞懸液裝瓶，5%CO2溫箱靜置培養(yǎng)，數(shù)天后細(xì)胞沉降并貼附在玻面上生長(zhǎng)分裂，最后長(zhǎng)成單層。哺乳動(dòng)物和禽類的細(xì)胞培養(yǎng)溫度一般為37℃。當(dāng)前15頁(yè)，總共51頁(yè)。（三）細(xì)胞培養(yǎng)的方法2.旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(rollerculture)：大規(guī)模生產(chǎn)疫苗。細(xì)胞在玻瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)時(shí)，玻瓶不斷緩慢旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞貼附于玻瓶四周，長(zhǎng)成單層。基本方法與靜置培養(yǎng)基本相同，不同之處是培養(yǎng)的細(xì)胞不斷緩慢旋轉(zhuǎn)（5-10r/h）。當(dāng)前16頁(yè)，總共51頁(yè)。（三）細(xì)胞培養(yǎng)的方法另外為滿足某些特定需要可采取懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)兩種1.懸浮培養(yǎng)(suspensionculture)：攪拌使細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，并不斷補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和矯正PH值，使之生長(zhǎng)或存活，適用于不需要貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞系。如NS-1（一種骨髓瘤細(xì)胞系）1.微載體培養(yǎng)(microcarrierculture)：在懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合微載體的培養(yǎng)技術(shù)，微載體直徑在100-200μm的微粒，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，細(xì)胞附著其上生長(zhǎng)成單層，由于單位體積表面積大，所獲得的細(xì)胞數(shù)多。對(duì)規(guī)模化細(xì)胞生產(chǎn)和疫苗生產(chǎn)有較大吸引力。當(dāng)前17頁(yè)，總共51頁(yè)。第二節(jié)病毒與細(xì)胞的相互作用殺細(xì)胞感染非殺細(xì)胞感染引致持續(xù)感染，對(duì)細(xì)胞代謝無(wú)影響。產(chǎn)生干擾素當(dāng)前18頁(yè)，總共51頁(yè)。病毒的種類千差萬(wàn)別，宿主的細(xì)胞的種類也多達(dá)200多種，病毒與宿主細(xì)胞之間的作用的表現(xiàn)形式各異。一、病毒與細(xì)胞相互作用的類型病毒感染可分為殺細(xì)胞及非殺細(xì)胞兩大類。并非所有的病毒感染都能產(chǎn)生和釋放子代病毒顆粒。宿主細(xì)胞感染病毒發(fā)生的變化可能是細(xì)胞死亡或細(xì)胞轉(zhuǎn)化，也可能是病毒非生產(chǎn)性感染，或稱頓挫感染。當(dāng)前19頁(yè)，總共51頁(yè)。某些種類的細(xì)胞是允許性的，可讓病毒完成復(fù)制過程；而另一些則阻斷了病毒的復(fù)制過程的某個(gè)環(huán)節(jié)，此類細(xì)胞稱為非允許性的。病毒感染允許性及非允許性細(xì)胞均可產(chǎn)生細(xì)胞的病理變化。當(dāng)前20頁(yè)，總共51頁(yè)。最重要的非生產(chǎn)性的病毒與細(xì)胞的相互作用是持續(xù)感染。持續(xù)感染（persistentinfection）：是指持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的感染。在感染過程中不形成感染性的病毒顆粒，可能是病毒的基因組被整合到宿主細(xì)胞DNA內(nèi)，或以附加體形式存在。潛伏感染的細(xì)胞在某些情況下并不釋放病毒顆粒，在被激活的情況下則可變?yōu)樯a(chǎn)性的。當(dāng)前21頁(yè)，總共51頁(yè)。二、病毒引致的殺細(xì)胞變化(一)細(xì)胞病變(cytopathiceffect,CPE)由病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。CPE能在光學(xué)顯微鏡下觀察。當(dāng)前22頁(yè)，總共51頁(yè)。50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）能夠使半數(shù)組織細(xì)胞在一定條件下發(fā)生細(xì)胞病變的病毒量。用于判定病毒的毒力。當(dāng)前23頁(yè)，總共51頁(yè)。細(xì)胞病變的表現(xiàn)因病毒與細(xì)胞的種類而異，有多種形式①細(xì)胞圓縮：如痘病毒和呼腸孤病毒等；②細(xì)胞聚合：如腺病毒；③形成合胞體：細(xì)胞融合形成，如副粘病毒和皰疹病毒；④細(xì)胞腫大：⑤包涵體：有些病毒可能形成。當(dāng)前24頁(yè)，總共51頁(yè)。CPE細(xì)胞腫大細(xì)胞圓縮形成合胞體當(dāng)前25頁(yè)，總共51頁(yè)。正常細(xì)胞CPECPE觀察當(dāng)前26頁(yè)，總共51頁(yè)。CPE觀察正常單層A72細(xì)胞接種犬冠狀病毒（CCV）后形成合胞體的的單層A72細(xì)胞當(dāng)前27頁(yè)，總共51頁(yè)。細(xì)胞折光性↑，變圓○，局部→全層，死亡脫落，如：腸道病毒。當(dāng)前28頁(yè)，總共51頁(yè)。細(xì)胞聚集成叢，似葡萄串狀，細(xì)胞間常有細(xì)絲狀間橋連接，細(xì)胞變圓或膨大，如：腺病毒。當(dāng)前29頁(yè)，總共51頁(yè)。細(xì)胞融合形成多核的巨細(xì)胞，稱為“合胞體”，如副粘、牛白血病病毒等。

當(dāng)前30頁(yè)，總共51頁(yè)。胞漿內(nèi)有空泡形成，如：猴病毒SV40、呼腸孤病毒等。當(dāng)前31頁(yè)，總共51頁(yè)。(1)病毒對(duì)宿主細(xì)胞膜的影響一些具有有融合活性的表面蛋白的有囊膜病毒能夠啟動(dòng)細(xì)胞之間的融合，形成多核細(xì)胞如合胞體病毒。當(dāng)前32頁(yè)，總共51頁(yè)。合胞體（syncytia）：是病毒感染后導(dǎo)致感染細(xì)胞及相鄰細(xì)胞細(xì)胞膜融合的產(chǎn)物，表現(xiàn)為若干細(xì)胞的相鄰細(xì)胞膜消失，成為多核巨細(xì)胞。當(dāng)前33頁(yè)，總共51頁(yè)。(2)病毒對(duì)細(xì)胞骨架的影響許多病毒的感染會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架纖維系統(tǒng)（細(xì)胞骨架由維絲、中介絲及維管組成）的瓦解。由于細(xì)胞骨架在維持細(xì)胞形態(tài)中起一定作用，所以病毒引起細(xì)胞骨架的改變是受染細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的原因之一。當(dāng)前34頁(yè)，總共51頁(yè)。病毒引致的細(xì)胞凋亡和壞死細(xì)胞的死亡則是因病毒感染引起了細(xì)胞的生理性死亡所致，亦即程序性死亡，或稱為凋亡(apoptosis)。凋亡與壞死的細(xì)胞有不同的形態(tài)變化，凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化。內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將細(xì)胞DNA降解成180-200dp的片段，可在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)出現(xiàn)特征性的電泳帶，稱之為“梯帶”。壞死的細(xì)胞沒有內(nèi)切酶激活所致的變化。凋亡是宿主細(xì)胞的重要防御機(jī)制，細(xì)胞壞死總是在病毒復(fù)制完成之后發(fā)生。當(dāng)前35頁(yè)，總共51頁(yè)。病毒引起的細(xì)胞調(diào)亡當(dāng)前36頁(yè)，總共51頁(yè)?？瞻咴囼?yàn)將適當(dāng)濃度的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)中，當(dāng)病毒吸附細(xì)胞后，再覆蓋一層融化的瓊脂。病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后產(chǎn)生局限性病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，肉眼也能看見，此即空斑試驗(yàn)。當(dāng)前37頁(yè)，總共51頁(yè)。當(dāng)前38頁(yè)，總共51頁(yè)。CELLS空斑是由一個(gè)感染性病毒粒子復(fù)制形成的，類似于細(xì)菌的菌落，稱為空斑形成單位(Plaque-formingunit，PFU)。病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升含有的PFU來(lái)表示。當(dāng)前39頁(yè)，總共51頁(yè)。當(dāng)前40頁(yè)，總共51頁(yè)。當(dāng)前41頁(yè)，總共51頁(yè)。空斑試驗(yàn)的用途：1.測(cè)定病毒數(shù)量2.純化病毒單個(gè)空斑作懸液，梯度稀釋后再作空斑，可獲得病毒克隆。3.鑒定病毒不同病毒的空斑具有不同的特征。當(dāng)前42頁(yè)，總共51頁(yè)。三、包涵體(inclusionbody)定義：是某些病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變化，在普通光學(xué)顯微鏡下可見胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小數(shù)量不等的圓形或不規(guī)則形的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，稱為包涵體。當(dāng)前43頁(yè)，總共51頁(yè)。包涵體的性質(zhì)病毒成分的蓄積，如狂犬病毒的Negri氏體大量晶格樣排列的病毒顆粒組成，如腺病毒的包涵體細(xì)胞變性的產(chǎn)物，不含病毒，如皰疹病毒的包涵體當(dāng)前44頁(yè)，總共51頁(yè)。意義——診斷（涂片或組織切片）——某些病毒的診斷依據(jù)——發(fā)現(xiàn)包涵體即可確診——狂犬病，小腦或大腦海馬角有內(nèi)基氏小體（圓形或卵圓形的嗜酸性小體）——C漿內(nèi)；喉氣管炎——C核內(nèi)。副流感病毒Ⅲ型，C漿內(nèi)、核內(nèi)都有。當(dāng)前45頁(yè)，總共51頁(yè)。當(dāng)前46頁(yè)，總共51頁(yè)。當(dāng)前47頁(yè)，總共51頁(yè)?？袢《景w（Negribody）當(dāng)前48頁(yè)，總共51頁(yè)。能產(chǎn)生包涵體的重要的畜禽病毒當(dāng)前49頁(yè)，總共51頁(yè)。四、病毒引致的非殺細(xì)胞變化非殺細(xì)胞病毒的感染通常引致持續(xù)感染，對(duì)細(xì)胞的新陳代謝并無(wú)大礙，但同時(shí)