活細胞分析檢測技術

活細胞分析檢測技術常規(guī)染色法檢測FCM技術檢測MTT法檢測MTT法的應用活細胞分析檢測技術共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!活細胞的檢測某些染料當細胞死亡時能透過變性的胞膜與解體的細胞核DNA結合，而令其著色。因而能鑒別細胞死活?；罴毎治鰴z測技術共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!一、臺盼藍排除法

1．試劑：

①4％臺盼藍母液：稱取4g盼藍，加少量雙蒸水研磨，加水（雙蒸）至100ml，離心后取上清液。②1.8％氯化鈉溶液。步驟：用前兩液以1:1混合，制成2%臺盼藍液。再取1滴細胞懸液和1滴2%臺盼藍液混合，放蓋片，置3分鐘，鏡下觀察200細胞。活細胞不著色，死細胞核呈藍色。計算百分比?；罴毎治鰴z測技術共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!二、中性紅排除法

步驟：（1）配1%中性紅水溶液（雙蒸水）。（2）染前用Hanks液作10倍稀釋，離心（1500轉/分）7分鐘，取上清為染液。（3）將細胞懸液與染液4:1混合，混勻后加蓋片靜置15～20分鐘。鏡下觀察。死細胞不著色，活細胞吸收中性紅液，呈紅色求百分率。活細胞分析檢測技術共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!四、苯胺黑排除試驗苯胺黑染色液毒性小，較長時間染色也不致傷害細胞，使死細胞增多。死細胞著染苯胺黑較臺盼藍和中性紅略慢，可用于鑒定細胞死活和微量細胞毒。試劑：1%苯胺黑水溶液（過濾后用），含2.5%小牛血清的生理鹽水。操作步驟：（1）取細胞，制成1～5×細胞/ml懸液。（2）染前將1%苯胺黑水溶液與含血清的生理鹽水作1:9混合稀釋，使其成為0.1%苯胺黑鹽水溶液。（3）取0.1ml細胞懸液和0.1ml苯胺黑鹽水溶液混合，置室溫10分鐘。（4）取1滴染色的細胞懸液滴于載片，覆以蓋片，高倍鏡下觀察，著染藍黑色者為死細胞。數(shù)200細胞分別計數(shù)死、活者，計數(shù)活細胞百分比?；罴毎治鰴z測技術共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!六、溴化乙啶（EB）和碘化丙啶（PI）排除法碘化丙啶（PropidiumIodine,PI）和溴化乙啶（Ethidiumbromide,EB）均屬啡啶類，為核酸嵌入型染料。可嵌入多核苷酸結構，與DUA雙鏈特異性結合。活細胞胞膜可排斥這兩種試劑穿透進入。而死細胞胞膜易被穿透，致使胞核著色，PI等對死活細胞的鑒別染色非常敏感，常用于FACS測定?；罴毎治鰴z測技術共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!單擊顯示

FCM在活細胞檢測中的應用活細胞分析檢測技術共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!線粒體中的脫氫酶(如琥珀酸脫氫酶、心肌黃酶)可將四甲基偶氮唑鹽(MTT)的唑環(huán)打開，生成藍色的產(chǎn)物formazan。根據(jù)這個原理，Mosmann于1983年創(chuàng)立了MTT檢測法，此法在測定細胞的存活和增殖方面非常有效，因為這種顏色的變化僅僅發(fā)生在活的細胞中，并且甲的形成量與活細胞數(shù)和功能狀態(tài)是成比例的。目前MTT測定法已經(jīng)廣泛地應用于多種生長因子如表皮生長因子、腫瘤壞死因子、白細胞介素-2等的檢測工作中?；罴毎治鰴z測技術共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!MTT測定已有效地應用于生物學和醫(yī)學的許多研究之中，如淋巴毒素，生長因子，白細胞介素-2，干擾素，淋巴細胞轉化和補體介導的細胞毒試驗，腫瘤壞死因子，抗腫瘤藥物的篩選以及抗人艾滋病毒（HIV）藥物的篩選?；罴毎治鰴z測技術共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!三、吖啶橙（AO）熒光染色法

（1）取少量血細胞、培養(yǎng)細胞或其它懸液細胞，數(shù)量在1×10級。（2）滴加0.01吖啶橙（AcriclineOrange,AO）生理鹽水液1～2滴，加蓋片后染色5分鐘。（用0.1%吖啶橙水溶液與0.1MPBS以1:9混合）。（3）熒光顯微鏡下觀察，采取激發(fā)濾片BG-12（或BV），阻斷濾片波長515nm士者。結果：活細胞的胞核呈黃綠色熒光，胞質呈綠色熒光，死細胞的胞核呈紅色熒光。嗜中性顆粒為桔紅。嗜酸和嗜堿性顆粒為鮮紅色。活細胞分析檢測技術共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!五、伊紅丫排除試驗：試劑：生理鹽水配制0.2%伊紅丫溶液操作步驟：（1）取細胞，制成1～5×細胞/ml懸液。（2）取0.1ml細胞懸液和0.1ml伊紅丫染液混合。（3）取1滴混合液滴于載片，加蓋片后置1分鐘，在高倍鏡下觀察，著紅染色者為死細胞。數(shù)200個細胞，分別計數(shù)活、死細胞，求活細胞百分比?；罴毎治鰴z測技術共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!七、雙醋酸熒光素（FDA）染色試劑：將雙醋酸熒光素（FDA）以mlg/mc溶于丙酮，分裝作為保存液。可于-20℃下長久保存。操作步驟；（1）用前，將保存液PBS稀釋成1:400,000。（2）將細胞滴加FDA稀釋液染色（3）將細胞標本立即置熒光顯微鏡下，用激發(fā)濾片藍紫、紫外、陰隔濾片515nm觀察，活細胞應呈綠色熒光?；罴毎治鰴z測技術共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!八、測定細胞存活和增殖的MTT方法用MTT法測定活細胞及細胞增殖，是基于黃色的MTT能被活細胞線粒體脫氫酶（如琥珀酸脫氫酶和心肌黃酶）還原成藍色的Formazan，從而可用比色法推測細胞濃度。死細胞或紅細胞沒有這種能力。甲脯產(chǎn)生的量與細胞數(shù)成正比，活化的細胞比靜止的細胞產(chǎn)生更多甲脯，其最大優(yōu)點是不需要任何洗滌步驟可以在酶標儀上快速分析和測定大量樣品。活細胞分析檢測技術共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!MTT測定法方法

對數(shù)生長期細胞按一定濃度接種100μl到96孔培養(yǎng)板(Costar)，設5個重復孔，空白為不含細胞的完全培養(yǎng)基，陰性對照為空白培養(yǎng)基及細胞。加入一定數(shù)量的MTT于孔中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)一定時間。然后每孔加入formazan溶解液，其中短時溶解液以加樣器混合，放置一定時間。肉眼觀察蛋白質絮狀沉淀情況，倒置顯微鏡下觀察針狀染料結晶的情況并判斷其溶解程度。用全自動酶標儀(BIO-RADMod