基因工程預(yù)習(xí)課件2

（優(yōu)選）基因工程預(yù)習(xí)課件當(dāng)前1頁，總共41頁。當(dāng)前2頁，總共41頁。基因工程的目的基因－－

從供體轉(zhuǎn)移到受體的基因，主要指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。與生物抗逆性相關(guān)的基因與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因與生物藥物和保健品相關(guān)的基因與毒物降解相關(guān)的基因與工業(yè)所需酶相關(guān)的基因具有調(diào)控作用的因子……當(dāng)前3頁，總共41頁。1、獲取目的基因的方法有哪些？一、目的基因的獲取2、什么叫基因文庫，它包括哪些種類？3、用PCR技術(shù)擴增基因需要哪些原料？一是從自然界中已有的物種中分離：二是用人工方法合成?，F(xiàn)代獲取方法：1、從基因文庫中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因3、化學(xué)方法人工合成當(dāng)前4頁，總共41頁。基因文庫：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫?；蛭膸?/p>

基因組文庫部分基因文庫(CDNA文庫)當(dāng)前5頁，總共41頁。某生物體內(nèi)全部DNA

許多DNA片段受體菌群體1、從基因文庫中獲取目的基因限制酶與運載體連接導(dǎo)入基因組文庫某種生物某個時期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運載體連接導(dǎo)入部分基因文庫（cDNA文庫）當(dāng)前6頁，總共41頁。文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）基因中內(nèi)含子（具有編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）物種間的基因交流基因文庫兩種類型小大無有無有某生物的全部基因基因多少某生物的部分基因可以部分基因可以當(dāng)前7頁，總共41頁。

為什么要構(gòu)建基因文庫?直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎?基因文庫是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體?；蛭膸炜梢詷?gòu)建所需的目的基因，并且不含有其他基因。直接從含有目的基因的生物內(nèi)提取理論上是可以，但是很麻煩；首先取得目的基因后的擴增，轉(zhuǎn)入受體細胞等操作都需要載體,目的基因片段無法確定是否能直接在受體細胞內(nèi)表達的。一般目的基因都很小，直接提取的話會含有很多其他片段的基因，難以將他們分離開來。問題當(dāng)前8頁，總共41頁。依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性4)從基因文庫中得到目的基因的方法當(dāng)前9頁，總共41頁。1、構(gòu)建基因組DNA文庫時，首先應(yīng)分離細胞的A、染色體DNA

B、線粒體DNAC、總mRNA

D、tRNA2、目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關(guān)基因文庫的描述正確的是A、某生物的全套基因就是一個基因文庫B、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導(dǎo)入某個生物體內(nèi)，則這個生物就是一個基因文庫C、含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫AC當(dāng)前10頁，總共41頁。問題2.什么是內(nèi)含子？3.什么是啟動子？1.什么是編碼蛋白質(zhì)序列？編碼蛋白質(zhì)序列是指在具有遺傳效應(yīng)的DNA片段內(nèi)，具有能通過轉(zhuǎn)錄和翻譯形成一定的氨基酸序列的脫氧核糖核苷酸序列。當(dāng)前11頁，總共41頁。基因a基因b基因c基因d間隔片段：不攜帶任何遺傳信息遺傳信息：具有遺傳效應(yīng)的DNA片段內(nèi)的堿基排列順序。基因的結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)當(dāng)前12頁，總共41頁。外顯子內(nèi)含子與RNA聚合酶結(jié)合位點編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點編碼區(qū)原核生物基因真核生物基因當(dāng)前13頁，總共41頁。1.原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)的異同點基因原核基因真核基因結(jié)構(gòu)示意圖非編碼區(qū)組成、作用編碼區(qū)組成、作用轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因功能非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)外顯子內(nèi)含子內(nèi)含調(diào)控序列，調(diào)控遺傳信息的表達，調(diào)控序列中有與RNA聚合酶結(jié)合位點。連續(xù)不間隔，編碼蛋白分為外顯子和內(nèi)含子，外顯子是編碼蛋白----間隔成熟的RNA內(nèi)含子，外顯子一起轉(zhuǎn)錄為初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，經(jīng)加工（剃除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的部分）成為成熟的RNA①通過復(fù)制在親代與子代之間傳遞遺傳信息②通過轉(zhuǎn)錄與翻譯表達遺傳信息（從而決定生物的性狀）。當(dāng)前14頁，總共41頁。

真核生物的基因是由基因編碼區(qū)和非編碼組成，編碼區(qū)內(nèi)又分為外顯子和內(nèi)含子,只有外顯子能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū),能轉(zhuǎn)錄響應(yīng)的信使RNA,進而指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。非編碼區(qū)，不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA,不能編碼蛋白質(zhì)，但具有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列，最重要的是有位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點。包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點和下游的非編碼區(qū)。原核生物基因就是編碼區(qū)和非編碼區(qū)。原核生物不能編碼蛋白質(zhì)的序列為非編碼區(qū)，而真核生物則有非編碼區(qū)和編碼區(qū)內(nèi)的內(nèi)含子。所以真核細胞的基因具有間隔性、不連續(xù)性，是因為包括：編碼區(qū)內(nèi)的外顯子、不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子以及非編碼區(qū)。2.什么是內(nèi)含子當(dāng)前15頁，總共41頁。啟動子位于DNA上，屬于基因非編碼區(qū)上游的核苷酸序列。啟動子上有與RNA聚合酶結(jié)合點。只有在啟動子存在時，RNA聚合酶才能準(zhǔn)確地識別轉(zhuǎn)錄起點，并沿著DNA編碼區(qū)正常地進行轉(zhuǎn)錄。3.什么是啟動子？啟動子與起始密碼的區(qū)別：內(nèi)含子沒有遺傳效應(yīng)，起始密碼位于mRNA上，只有兩種：AUG和GUG，既決定一種氨基酸，同時做肽鏈合成的啟動信號。終止子與終止碼同理。二者對于基因而言的，編碼的部分為外顯子，不編碼的為內(nèi)含子。當(dāng)前16頁，總共41頁。

2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因

稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)穆里斯等人于1988年發(fā)明的。PCR是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。當(dāng)前17頁，總共41頁。①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________、___________.②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸引物DNA聚合酶指數(shù)2nDNA復(fù)制當(dāng)前18頁，總共41頁。高溫變性中溫延伸低溫復(fù)性PCR當(dāng)前19頁，總共41頁。在TaqDNA聚合酶的作用下，以四種脫氧核苷酸為原料，進行延伸，合成與模板互補的DNA鏈。⑤反應(yīng)過程：a.變性(90～95℃):b.復(fù)性（退火）(55～60℃):c.延伸(70～75℃):DNA模板解鏈引物與模板結(jié)合，形成局部雙鏈d.多次重復(fù)當(dāng)前20頁，總共41頁。PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時會變性；3.PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制受生物體遺傳物質(zhì)的控制。

4.PCR不需要ATP,體內(nèi)DNA復(fù)制需要；當(dāng)前21頁，總共41頁。PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴增當(dāng)前22頁，總共41頁。細胞內(nèi)復(fù)制

.VS.PCR擴增DNA母鏈4種

脫氧核苷酸DNA聚合酶（Taq酶）引物（2個）溫度控制1）模板：2）原料：3）酶：DNA母鏈4種脫氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶

DNA增殖4）特點:半保留復(fù)制邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制全解旋再復(fù)制當(dāng)前23頁，總共41頁。反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA目的基因化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推測推測單鏈DNA合成3.人工合成—化學(xué)合成法基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成當(dāng)前24頁，總共41頁。？基因表達載體包括哪些必需組分？各組分有什么作用？二.基因表達載體的構(gòu)建當(dāng)前25頁，總共41頁。基因表達載體的模式圖基因表達除含有目的基因外，還需要以下元件：啟動子終止子標(biāo)記基因當(dāng)前26頁，總共41頁。基因表達載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個切口兩個黏性末端當(dāng)前27頁，總共41頁。①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。注意當(dāng)前28頁，總共41頁。啟動(終止)轉(zhuǎn)錄啟動(終止)翻譯作用位于DNA上位于mRNA上位置DNA片段三個相鄰堿基本質(zhì)啟動(終止)子啟始(終止)密碼子當(dāng)前29頁，總共41頁。？什么是轉(zhuǎn)化？將目的基因?qū)胫参?、動物、微生物細胞的方法分別有哪些？三.將目的基因?qū)胧荏w細胞當(dāng)前30頁，總共41頁。轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。常用的受體細胞：

有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。當(dāng)前31頁，總共41頁。將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)感受態(tài)法受體細胞植物細胞動物細胞原核細胞當(dāng)前32頁，總共41頁。1.將目的基因?qū)胫参锛毎?---農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法當(dāng)前33頁，總共41頁。適用于單子葉植物基因槍法當(dāng)前34頁，總共41頁。胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊當(dāng)前35頁，總共41頁?；ǚ酃芡ǖ婪ㄟm用于被子植物當(dāng)前36頁，總共41頁。三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1.將目的基因?qū)胫参锛毎D(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱游锛毎峒兓虮磉_載體體外顯微注射入受精卵受精卵移植顯微注射技術(shù)當(dāng)前37頁，總共41頁。三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1.將目的基因?qū)胫参锛毎D(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射技術(shù)3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎鸆a2+處理法當(dāng)前38頁，總共41頁。

四、目的基因的檢測與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細胞都能攝入重組DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。目的基因進入受體細胞后，是否都能穩(wěn)定