云南省基因組健康檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

T/YEMSXX-2022團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)基因組健康評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范Technicalspecificationforgenomichealthassessment（征求意見(jiàn)稿）2022-XX—XX發(fā)布 2022-XX—XX實(shí)施云南省環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)發(fā)布T/YEMSXX-2022T/YEMSXX-2022目次前言 1范圍 2規(guī)范性引用文件 2術(shù)語(yǔ)和定義 2基因組健康檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室要求 3基因組健康檢測(cè)人員要求 4核心技術(shù)要素 4人類遺傳資源與信息保護(hù)規(guī)則 6附錄A（規(guī)范性附錄）基因組損傷生物標(biāo)記信息表 7附錄B(規(guī)范性附錄)主要試劑和儀器設(shè)備 8附錄C（規(guī)范性附錄）基因組損傷識(shí)別圖譜 9參考文獻(xiàn) 11PAGEPAGE4前言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草原則》、GB/T20000《標(biāo)準(zhǔn)化工作指南》、GB/T20001《標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則》、GB/T20004《團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)化》的規(guī)定起草。本文件由云南省環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)提出。本文件由云南省環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：云南省環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)（營(yíng)養(yǎng)基因組學(xué)專業(yè)委員會(huì)）、云本文件主要起草人：汪旭、倪娟、范麗仙、郭錫漢、王晗、薛京倫、周滔本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布?；蚪M健康評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了基因組損傷無(wú)創(chuàng)檢測(cè)的細(xì)胞分子生物學(xué)原理與技術(shù)、操作規(guī)范。規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件，局部參考：《遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》《ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)-中文版》《中華人民共和國(guó)人類遺傳資源管理?xiàng)l例》《分子遺傳學(xué)基因檢測(cè)送檢和咨詢規(guī)范與倫理指導(dǎo)原則2018中國(guó)專家共識(shí)》術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。Genome生物體一套完整遺傳物質(zhì)的總和。高等真核生物的基因組，為其配子所有染色體DNA的總和?；蚪M損傷Genomicdamage基因組中發(fā)生的核苷酸序列及其修飾等結(jié)構(gòu)變異與功能異常、端粒長(zhǎng)度異常改變、染色體行為錯(cuò)誤等遺傳學(xué)事件。binucleatedcells經(jīng)細(xì)胞質(zhì)分裂阻斷，二個(gè)完成核分裂的子細(xì)胞核處于同一細(xì)胞質(zhì)范圍內(nèi)的細(xì)胞。Micronucleusinbinucleatedcells經(jīng)細(xì)胞松弛素B阻斷細(xì)胞質(zhì)分裂、完成核分裂的細(xì)胞中，游離于主核的染色質(zhì)小體；由無(wú)著絲粒染色體斷片或多種機(jī)制誘發(fā)的落后染色體構(gòu)成。Nucleoplasmicbridgeinbinucleatedcells經(jīng)細(xì)胞松弛素B阻斷細(xì)胞質(zhì)分裂的雙核細(xì)胞中，細(xì)胞核之間形成的直徑小于主核1/4的染色質(zhì)絲狀連接；為染色體斷裂后錯(cuò)誤重接、端粒融合或雙著絲粒染色體等事件引起。Nuclearbuds無(wú)著絲?；驘o(wú)端粒DNA在核內(nèi)異常擴(kuò)增后經(jīng)核膜表面排除、形成未脫落的染色質(zhì)小體。DNA-末端融合的重要染色體結(jié)構(gòu)組分。端粒長(zhǎng)度異常是基因組不穩(wěn)定性增加的標(biāo)志之一。實(shí)驗(yàn)室通用要求15030DNA實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程產(chǎn)生的污物廢液以滅菌消毒法進(jìn)行安全處理。核心技術(shù)規(guī)范無(wú)創(chuàng)外周靜脈血取樣HBVHCVHIV和梅毒3ml，48DNA提取。淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及制片RPMI164010%2mML-Glu30μg/mL1mM100IU/mL淋巴細(xì)胞分離和計(jì)數(shù)質(zhì)量要求：外周靜脈血樣于室溫（15-28℃）HBSS稀釋鋪于淋巴細(xì)胞分離液表面，離心后細(xì)胞計(jì)數(shù)。0.5×106RPMI16405%CO244B28固定、染色及封片。6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)量平均端粒長(zhǎng)度。1436B4序列制備單拷貝基因標(biāo)準(zhǔn)品，度量樣本基因組倍數(shù)。反應(yīng)結(jié)束后，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到目標(biāo)樣本的端?？傞L(zhǎng)度T（kb/reaction）S（基因組拷貝數(shù)（TL/diploidgenome,Kb），除以染色體總數(shù)后得到樣本的平均端粒長(zhǎng)度（Kb）?；蚪M損傷判斷標(biāo)準(zhǔn)B胞質(zhì)阻斷的雙核細(xì)胞微核、核質(zhì)橋和核芽頻率1/3即提示基因組損傷的高水平。同一細(xì)胞質(zhì)范圍內(nèi)；雙核細(xì)胞中的兩個(gè)細(xì)胞核大小均等，著色深淺和折光度基本一致；細(xì)胞質(zhì)邊界完整，與相鄰細(xì)胞界限清晰。雙核細(xì)胞微核判斷標(biāo)準(zhǔn)：雙核細(xì)胞中的微核的直徑通常為主核的1/16～1/3，與主核的著色深度基本一致。1/4，其著色特征應(yīng)與主核相一致。30~60天的兩次平均端粒長(zhǎng)度若出現(xiàn)顯著差異，指示端粒長(zhǎng)度的異常變化，異常改變的幅度與基因組損傷程度呈正比?；蚪M損傷評(píng)判質(zhì)控：外周血抗凝取樣后需在48小時(shí)之內(nèi)完成淋巴細(xì)胞分離并立即進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞制片后需雙盲顯微分析，1000倍放大觀察計(jì)數(shù)各個(gè)基因組損傷標(biāo)志出現(xiàn)千分率，顯微影像和數(shù)據(jù)信息均需準(zhǔn)確留檔備查。標(biāo)準(zhǔn)曲Ct值的標(biāo)準(zhǔn)誤﹤1Ct（CV﹥5%）。10年。人類遺傳資源與信息保護(hù)規(guī)則本文件所指的遺傳資源為含有人體基因組的外周血淋巴細(xì)胞，信息指利用外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的數(shù)據(jù)資料。所有樣本采集與保存、數(shù)據(jù)處理，遵循《中華人民共和國(guó)人類遺傳資源管理?xiàng)l例》（中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院令，第717號(hào)）。PAGEPAGE7附錄A（規(guī)范性附錄）基因組損傷Th物標(biāo)記信息表序號(hào)基因組判斷標(biāo)準(zhǔn)1雙核細(xì)胞（BN）兩個(gè)細(xì)胞核均具有完整核膜，并位于同一細(xì)胞質(zhì)范圍內(nèi)；兩個(gè)細(xì)胞核應(yīng)大小均等，著色深淺和折光度基本一致；兩個(gè)主核可能接觸但是理想的情況下不重疊；雙核細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，并與相鄰細(xì)胞清晰分開(kāi)。2（MN）1/16～1/色深度基本一致。3雙核細(xì)胞核質(zhì)橋（NPB）雙核細(xì)胞中的核質(zhì)橋通常不超過(guò)主核直徑的1/4，其著色特征應(yīng)與主核一致。4（NBUD）雙核細(xì)胞中的核芽與微核有相似的形態(tài)和著色特征，但以小柄與主核相連。5端粒長(zhǎng)度異常30~60均端粒長(zhǎng)度出現(xiàn)顯著差異。附錄B(規(guī)范性附錄)主要試劑和儀器設(shè)備主要試劑：1、淋巴細(xì)胞分離液，無(wú)菌，100ml，4℃保存。開(kāi)瓶后暴露于空氣后易變質(zhì)，使用時(shí)應(yīng)保留原包裝蠟封，按需用注射器吸出，20-22℃使用。2、Hank’s平衡液，高壓滅菌，4℃保存，20-22℃下使用。3、GibcoPPMI1640培養(yǎng)液，不含谷氨酰胺（L-Glu），無(wú)菌。4℃保存，使用前置室溫1小時(shí)。437FBS43天，避免反復(fù)凍融。5L-Glueppendorf管分裝后-20℃凍存，使用前室溫解凍。6100mM，過(guò)濾滅菌，1.5mleppendorf管分裝后-20℃凍存，使用前室溫解凍。7、細(xì)胞松弛素B(Cyt-B)，以DMSO制備600μg/ml原液，分裝，-20℃保存，使用前解凍。8、植物血球凝集素-P（PHA-P），以無(wú)菌生理鹽水制備2.25mg/ml原液，分裝，4℃保存。主要儀器設(shè)備：1、二氧化碳培養(yǎng)箱2、生物安全柜3、純水儀4、高速冷凍離心機(jī)5、壓力蒸汽滅菌鍋6、研究顯微鏡7、涂片離心機(jī)8、低速離心機(jī)9、熒光定量PCR儀附錄C（規(guī)范性附錄）基因組損傷識(shí)別圖譜(X1000)胞質(zhì)阻斷雙核細(xì)胞 雙核細(xì)胞微核雙核細(xì)胞核質(zhì)橋 雙核細(xì)胞核芽PCR

端粒測(cè)量RT-qPCR引物及標(biāo)準(zhǔn)品序列引物及標(biāo)準(zhǔn)品 引物序列(5’-3’) 產(chǎn)物長(zhǎng)度36B4-F（SF） CAGCAAGTGGGAAGGTGTCC 76bp36B4-R（SR） CCCTCATCAACGGGTACAACGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTtelo-F（TF）Primers

telo-R（TR）

TGGGTTTGGGTT75bpGGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTelomerestandard (TTAGGG)14 84bpCAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCCGTCTCCACAStandards

36B4standard

75bpPAGEPAGE10 端粒標(biāo)準(zhǔn)曲線 單拷貝基因36B4標(biāo)準(zhǔn)曲線端粒長(zhǎng)度在檢測(cè)周期內(nèi)變化分析樣表參考文獻(xiàn)MFenech.Cytokinesis-blockmicronucleuscytomeNatureProtocols,2007,2(5):1084-1104.MFenech.TheGenomeHealthClinicandGenomeHealthNutrigenomicsconcepts:diagnosisandnutritionaltreatmentofgenomeandepigenomedamageonanindividualbasis.Mutagenesis,2005,20(4):255-269.MFenech.Genomehealthnutrigenomicsandnutrigenetics-diagnosisandnutritionaltreatmentofgenomedamageonanindividualbasis.FoodChemical2008,46:1365-1370.XuXiayuZQLiang,Huang,MichaelFenech*,JinglunXue*.Acomparisonofgenomicinstabilityunderfolicaciddeficiencybetweenbreastcancerpatientsandnormalnor-cancercontrolsfromaChinesepopulationinMutagenesis,2006,21:41-47.JuanNi,LinLu,MichaelFenech*,XuFolateDeficiencyinHumanPeripheralBloodLymphocytesInducesChromosome8AneuploidybutThisEffectisnotModifiedbyRiboflavin.EnvironmentalandMolecularMutagenesis,2010,51(1):15-22.LingLu,JuanNi,TianningZhou,Xu,MichaelFenech*,XuCholineand/orFolicAcidDeficiencyisAssociatedwithGenomicDamageandCellDeathinHumanLymphocytesinvitro.Nutritionand2012,64(3):481-487.GuoX,H,NiJ,etal.Geraniinselectivelypromotescytostasisandapoptosisinhumancolorectalcancercellsbyinducingcatastrophic