腫瘤的血管生成

腫瘤血管生成的分子機制

及常用探討方法

重慶醫(yī)科高校病理教研室

葉秀峰腫瘤血管生成的分子機制及常用探討方法

主要內(nèi)容:第一節(jié)腫瘤血管生成的基本過程其次節(jié)腫瘤微血管形態(tài)和生物學特性第三節(jié)腫瘤血管生成的調(diào)控機制第四節(jié)抗血管生成療法在腫瘤治療中的應用第五節(jié)腫瘤血管生成常用探討方法人體腫瘤大部分為實體瘤。實體瘤瘤組織由瘤細胞和間質構成，后者主要包括血管、淋巴管、結締組織、炎細胞及細胞外基質等成分。其中血管和結締組織起養(yǎng)分、支持瘤細胞的作用。腫瘤內(nèi)的新生血管和淋巴管分別通過血管生成(angiogenesis)和淋巴管生成(1ymphangiogenesis)實現(xiàn)的，并在腫瘤的生長和擴散(侵襲和轉移)中起重要作用。已有探討證明，腫瘤血管生成活躍程度對組織病理分級、放射治療以及在預后推斷上都有重要的評估價值。第一節(jié)腫瘤血管生成的基本過程一、血管生成現(xiàn)象1945年Algire提出了“腫瘤血管生成(tumorangiogenesis)”或“血管新生化(neovasclarzation)”概念。對血管生成重要性的相識，特殊是提出“腫瘤生長依靠于血管生成”觀點，始于1971年Folkman對腫瘤血管生成的探討報道。

血管生成是指活體組織在已存在的微血管床上芽生出新的以毛細血管為主的血管系統(tǒng)的過程。有別于胚胎時期由早期內(nèi)皮細胞分化形成新血管的過程即血管形成(vasculogenesis)。二．腫瘤血管生成的基本過程(一)血管生成的基本步驟：①血管生成因子的產(chǎn)生過多使之與抑制因子失衡，導致內(nèi)皮細胞激活，產(chǎn)生血管生成表型；②血管部位細胞外基質變更、基底膜降解，內(nèi)皮細胞芽生、增殖和遷移；③新生內(nèi)皮細胞索形成管狀毛細血管襻及管腔；④新生血管管腔的貫穿。(二)腫瘤血管生成的過程1．腫瘤生長的階段性①無血管期(avascularphase)或稱血管前期(prevascularphase)腫瘤直徑不超過1～2mm②血管期(vascularphase)腫瘤快速生長并發(fā)生轉移2.腫瘤血管的起源腫瘤中的血管可能有3種來源：①血管生成:以兩種方式發(fā)生,一是腫瘤細胞團先處于無血管期生長，后因缺氧而產(chǎn)生大量血管生成因子，從而誘導血管生成；另一種是瘤細胞先依靠宿主組織已存在的血管生長，繼而出現(xiàn)瘤內(nèi)血管消退，然后再因缺氧誘導血管生成因子作用而發(fā)生血管生成。②血管套疊性生長③內(nèi)皮祖細胞(endothelialprogenitorcell,EPC)EPC為血管內(nèi)皮細胞的前體細胞,參與胚胎的血管生成,也稱為成血管細胞。EPC主要來源于骨髓,表達CD133、CD34和VEGFR2。3．腫瘤血管生成的過程瘤細胞和巨噬細胞→血管生成因子(VEGF)等→小血管或毛細血管伸展→內(nèi)皮細胞遷移形成毛細血管芽→新生毛細血管形成并連通。其次節(jié)腫瘤微血管形態(tài)和生物學特性腫瘤微血管不僅在形態(tài)上不同于正常血管，而且在生物學功能上也有其特殊性。一．腫瘤微血管形態(tài)表現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)新生的微血管一般遍布整個腫瘤組織，但分布上并不均一。血管生成最活躍、微血管密度最高的區(qū)域被稱為所謂“血管熱點區(qū)”(hotspots)，這也是進行腫瘤微血管密度測定的選擇區(qū)域。很多腫瘤的微血管新生主要分布在腫瘤生長活躍的邊緣。腫瘤的新生血管分布上常常無規(guī)律，分支紊亂，管腔不規(guī)則，表現(xiàn)為狹窄、擴張或扭曲。新生血管呈血竇狀、條索狀，管壁薄，甚至僅有一層內(nèi)皮細胞；或管壁很厚，但結構上仍舊不完善。內(nèi)皮細胞比較無趣，細胞間常有裂隙，且缺乏基底膜，有時血管外的腫瘤細胞可干脆與血管管腔相連。腫瘤血管的結構缺陷是這些血管具有高通透性的結構基礎，也是腫瘤轉移途徑之一。不同類型腫瘤間質血管沒有本質區(qū)分，但在形態(tài)和數(shù)量上卻有不同。生長活躍的惡性腫瘤常富于血管。如內(nèi)分泌腫瘤、腎癌、骨肉瘤、絨毛膜癌、破骨細胞瘤、膠質母細胞瘤和肝細胞癌等。不同腫瘤血管的形態(tài)又有確定的差異，如膠質母細胞瘤中新生血管不僅豐富，而且內(nèi)皮細胞呈不同程度的增生、肥大；絨毛膜癌、肝細胞癌等血管呈壁薄、明顯擴張的血竇。總之，腫瘤微血管形態(tài)特點是：遍布整個腫瘤組織，但分布不均一，無規(guī)律，分支紊亂；管腔不規(guī)則，結構上不完善；內(nèi)皮細胞比較無趣，細胞間常有裂隙，且缺乏基底膜，有時血管外的腫瘤細胞可干脆與血管管腔相連。腫瘤血管的結構缺陷是其具有高通透性的結構基礎，也是腫瘤轉移途徑之一。二、腫瘤微血管的生物學特性①低反應性②高通透性③低供氧實力

第三節(jié)腫瘤血管生成的調(diào)控機制一、血管生成因子

(一)VEGF及其受體家族

(二)細胞外基質與基質金屬蛋白酶

(三)Ets家族成員

(四)纖維母細胞生長因子(FGF)家族及其受體

(五)血小板源內(nèi)皮細胞生長因子(PD-ECGF)（六）其它血管生成因子二.血管生成抑制因子（一）大分子蛋白前體酶解片段

(二)細胞因子（三）絲氨酸蛋白酶抑制劑（四）組織金屬蛋白酶抑制劑（五）抑癌基因腫瘤血管生成受多種血管生成因子(angiogenicfactors)和血管生成抑制物(angiogenesisinhibitors)的調(diào)控。腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞受缺氧刺激等使局部微環(huán)境發(fā)生變更的因素作用而合成和釋放大量血管生成因子從不同環(huán)節(jié)促進血管生成。組織中同時也存在內(nèi)源性血管生成抑制因子，對血管生成起抑制作用。一、血管生成因子血管生成的始動須要血管生成因子。一系列血管生成因子、細胞因子、細胞外基質和黏附分子及其抑制物，以及代謝性和機械性因子均參與了血管生成過程。(一)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體家族1．血管內(nèi)皮生長因子家族血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）又稱血管通透性因子(vascularpermeabilityfactor,VPF)，為分子量34-45kD的同源二聚體糖蛋白。VEGF基因通過轉錄水平的剪切，可產(chǎn)生5種變異體，即VEGF206、VEGFl89、VEGFl65、VEGFl45和VEGFl21，分別由206、189、165、145和121個氨基酸組成。其中以VEGF165最具特征性，其次是VEGF121二者均為可溶性分泌蛋白，擴散力強，易于到達靶細胞。近年又發(fā)覺其他一些與VEGF功能相像、結構上有確定同源性的多肽因子，包括胎盤生長因子(placentorgrowthfactor，PIGF)，VEGF-B(VEGF相關因子，VEGF-relatedfactor，VRF)，VEGF-C(VEGF相關蛋白，VEGF-relatedprotein，VRP)，以及VEGF-D／FIGF和VEGF-E等成員，它們共同構成VEGF家族。VEGF主要由血管四周的細胞產(chǎn)生，并通過旁分泌機制作用于內(nèi)皮細胞，在促進血管形成、抑制內(nèi)皮細胞的凋亡及提高血管通透性等方面發(fā)揮重要作用。2．VEGF受體類型：VEGF只有與其特異性受體結合后才能發(fā)揮生物學功能。目前，已鑒定并克隆出3種受體，即VEGF受體l(VEGFR-1，又稱flt-1)、VEGF受體2(VEGFR-2，又稱flk-1或KDR)及VEGF受體3(VEGFR-3又稱flt-4),均屬酪氨酸激酶受體，稱為Flt家族。前兩種受體一般只表達于血管內(nèi)皮細胞表面，但間或在其它類型細胞，如腫瘤細胞中也有表達；Flt-4在胎兒早期靜脈的內(nèi)皮細胞上呈一過性表達,胎兒后期和誕生后的內(nèi)皮細胞則不再表達；在成人Flt-4只在淋巴管的內(nèi)皮細胞上表達。由于Flt家族基因的表達部位不同，其配體的結合部位也不同。早期血管的形成須要VEGF的調(diào)整，它們與內(nèi)皮細胞上相應的酪氨酸激酶受體結合，引起內(nèi)皮細胞分裂和分化，并形成管腔樣結構。在胚胎發(fā)育過程中，VEGF(主要是VEGF-A)通過其受體VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1／KDR)促進內(nèi)皮分化、增殖、遷移和原始血管形成。由新形成的內(nèi)皮組裝成管腔樣結構須要VEGFR-1的表達和激活，而VEGFR-3的表達與內(nèi)皮細胞形成靜脈或淋巴管有關。VEGF不僅是內(nèi)皮細胞特異的強效有絲分裂原，而且能促進內(nèi)皮細胞產(chǎn)生并調(diào)整纖溶酶原激活物及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管生成中發(fā)揮重要作用。VEGF在幾乎全部的人體腫瘤和腫瘤細胞株中皆有過表達。VEGF及其受體在腫瘤中的表達常與腫瘤分化程度親密相關。大多數(shù)實體瘤VEGF基因均有過表達，VEGF165、VEGF121兩種VEGF最常見。在VEGF家族中，VEGF-C和VEG-D既可誘導血管生成，又可誘導淋巴管生成。已有探討報道，人體多種腫瘤細胞高表達VEGF-C。體內(nèi)轉基因試驗也證明，腫瘤細胞VEGF-C的高表達能選擇性地誘導腫瘤組織淋巴管生成。腫瘤組織中的VEGF-C和VEGF-D還來源于浸潤的巨噬細胞。

缺氧是很多細胞系產(chǎn)生VEGF的一個猛烈的誘導因子。離體條件下，葡萄糖缺乏亦是VEGF表達的誘因。VEGF在腫瘤壞死灶周邊常呈強表達。腫瘤中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達水平常與VEGF呈正相關，NO與VEGF之間具有相互調(diào)整作用。多種癌基因的激活通過上調(diào)VEGF表達而誘導血管生成，失活的抑癌基因(如突變型p53基因)也參與了VEGF介導的血管生成過程。(二)細胞外基質與基質金屬蛋白酶細胞外基質：人體各種組織均由細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)構成支架，依據(jù)其分布部位、組成成分及功能的不同可將其分為基膜(BM)和間質結締組織兩大類。ECM成分由4大家族組成：膠原蛋白、蛋白多糖、彈性蛋白、ECM糖蛋白。目前發(fā)覺ECM糖蛋白有10余種，如層粘連蛋白、纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)等。其中FN主要分布于皮膚、肌腱、血管壁和骨基質等組織。多數(shù)ECM糖蛋白具有粘附功能，這種功能的發(fā)揮與其分子內(nèi)部含有的某些特殊的蛋白片段有關，通過這些片段，ECM糖蛋白就可以與細胞及ECM其它成分結合，參與細胞的粘附、遷移、生長和分化。2.基質金屬蛋白酶的家族成員：隨著現(xiàn)代基礎醫(yī)學科學理論和試驗技術的飛速發(fā)展，大量的MMPs被發(fā)覺、分別、純化及測序。它們廣泛地分布于動植物界，幾乎能降解全部生物體內(nèi)的ECM成分。到目前為止，MMPs家族至少包含20種酶，而且其新成員仍在接著增加。3.基質金屬蛋白酶的促新血管形成作用：電鏡視察顯示，新的毛細血管圍成環(huán)狀及新合成的細胞外基質成分沉積、鋪墊后，血管環(huán)前端新合成的BM就起先了MMPs所介導的蛋白水解過程，內(nèi)皮細胞遷移將始于局部水解，形成一個新的毛細血管芽，隨后又經(jīng)驗了一系列細胞外蛋白水解酶的活化與抑制的動態(tài)循環(huán)。體外細胞培育發(fā)覺，當將人臍靜脈內(nèi)皮細胞培育于BM樣物質上時，內(nèi)皮細胞很快排成直線，圍成管狀，編織成血管網(wǎng)。4.MMPs在不同癌組織中的表達：人類癌組織種類繁多，探討癌細胞所產(chǎn)生的各種MMPs分子的特點及其在各種癌組織中的分布狀況，對了解癌的浸潤和轉移過程有重要意義。已有資料表明，不同種類的癌細胞所表達的MMPs分子種類和表達量也不相同。例如:乳腺癌:MMP-7，-8及-13表達量明顯高于正常乳腺組織。5.MMPs激活與癌的浸潤和轉移：多數(shù)癌組織中潛在型MMP-2的激活程度是癌發(fā)生轉移的重要指標。因此檢測癌組織內(nèi)MMP-2活化酶MT-MMP對癌的治療具有重要意義。

(三)Ets家族成員Ets原癌基因于1983年分別在不同的試驗室中分別成功。迄今發(fā)覺至少有Ets-1、Ets-2等11種Ets基因家族成員。Ets-1與新血管形成：血管四周基膜的分解和內(nèi)皮細胞本身的遷移力是血管生成的兩個關鍵因素。前者主要與MMPl有關，后者則主要與Ets-1有關。已發(fā)覺的4種典型的血管生長因子aFGF、bFGF、VEGF及EGF都能調(diào)整人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)、ECV-304細胞以及人網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞中的ets-1mRNA的表達。上述培育的細胞當受到生長因子等刺激時，2小時后其ets-lmRNA的表達呈最高值，12小時后又復原到原來水平。如用VEGF刺激培育的內(nèi)皮細胞時，其DNA-Ets復合物明顯增多；而用VEGF和GGAA(Ets功能域的競爭性抑制劑，controlcompetior)，同時刺激培育的內(nèi)皮細胞時，DNA-Ets復合物的量則明顯削減。血管生長因子作用于內(nèi)皮細胞時能夠引起內(nèi)皮細胞Ets-1mRNA的表達，而且其作用受轉錄水平的調(diào)整。(四)纖維母細胞生長因子(FGF)家族及其受體目前探討最為深化的是堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)，兩者在結構上是相關的。bFGF是一種廣泛存在于人體各組織中的生物活性物質，被認為是血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、神經(jīng)細胞等生長的刺激物。bFGF是體內(nèi)分布廣泛的生長因子之一，如腦、心、肝、胎盤和白細胞等均有存在。bFGF除分布于細胞內(nèi)，還分布于很多細胞的胞膜及胞外基質中。它也可在不同腫瘤中表達，包括膀胱癌、神經(jīng)膠質瘤、肝癌、胃腸癌、乳腺癌、腎細胞癌和甲狀腺癌等很多培育的細胞系都可以合成它。其功能具有多樣性，可促進內(nèi)皮細胞的有絲分裂、趨化性和遷移，刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生膠原酶降解基底膜，誘導來源于中胚層和神經(jīng)外胚層細胞的增殖和分化。bFGF也表現(xiàn)出親神經(jīng)性行為，促進神經(jīng)元的存活和分化。bFGF和aFGF均與肝素有很強的親和力，探討表明這種高親和力對于FGF與細胞表達的受體結合是特別重要的。bFGF的生物學作用是通過與其特異性的細胞表面受體FGF受體(FGFreceptors，F(xiàn)GFR)結合而介導實現(xiàn)的。已經(jīng)識別4種FGFR，包括FGFR-1(flg)、FGFR-2(bek)、FGFR-3和FGFR-4。FGFR-1在bFGF／FGFR系統(tǒng)中的作用最大。正常腦神經(jīng)元和膠質細胞中FGFR-1的表達呈現(xiàn)明顯的異質性，即組織中有些細胞呈現(xiàn)FGFR-1陽性，有些則顯示陰性；血管內(nèi)皮細胞亦是如此。(五)血小板源內(nèi)皮細胞生長因子(PDGF)

血小板源性生長因子(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)是由多種細胞產(chǎn)生的肽類生長因子。由于其在組織修復、胚胎發(fā)育、免疫及多種常見疾病的愈復中起著重要作用。除血小板外，單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞、血管內(nèi)皮細胞、胎盤和胚胎細胞、系膜細胞及某些腫瘤細胞均可產(chǎn)生和釋放PDGF。纖維母細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞及神經(jīng)細胞等多種細胞均存在PDGF受體。PDGF與細胞膜上的專一受體結合后可誘發(fā)一系列細胞內(nèi)反應而發(fā)揮生物學效應，主要表現(xiàn)在3方面：①促進細胞的有絲分裂：PDGF能刺激多種細胞如血管內(nèi)皮細胞、纖維母細胞和膠質細胞等的分裂、增殖；②趨化性：PDGF對纖維母細胞、平滑肌細胞和嗜中性粒細胞有趨化性，β受體介導趨化反應，而α受體則抑制趨化反應；③血管收縮效應：PDGF收縮大鼠主動脈的作用較經(jīng)典的血管驚惶素II更猛烈。此外，PDGF通過影響骨骼肌中細胞骨架與細胞膜的相互作用而致細胞骨架重排，還參與胚胎的發(fā)育和生長以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程。（六）其它血管生成因子舒血管素(Angiotropin)、血管新生素（Angiogenin）表皮生長因子、轉化生長因子等也能刺激內(nèi)皮細胞生長。此外，缺氧是腫瘤和非腫瘤性疾病血管生成的重要刺激因素。缺氧誘導的相關轉錄因子包括缺氧誘導因子-1、-2(hypoxiainducingfactor-l，-2，HIF-1．HIF-2)和NF-κB,其中以HIF-l在血管生成中的作用最為重要。血管生成因子二.血管生成抑制因子體內(nèi)存在內(nèi)源性的血管生成抑制因子，它們通過影響血管生成過程的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮抗血管生成的活性。血管生成抑制因子大致可分為7類：大分子蛋白前體酶解片段、細胞因子、絲氨酸蛋白酶抑制劑、含TSPI型重復模序的血管生成抑制因子、組織金屬蛋白酶抑制劑、抑癌基因及其它血管生成抑制因子。（一）大分子蛋白前體酶解片段這些大分子蛋白前體分別來源于血漿(如纖溶酶原、抗凝血酶)和胞外基質(如膠原蛋白、基底膜蛋白多糖、纖連蛋白)。1.纖溶酶原酶解片段——血管生成抑制素血管生成抑制素(angiostatin)是最先發(fā)覺的內(nèi)源性血管生成抑制因子之一，它是纖溶酶原的蛋白酶解產(chǎn)物，最初在Lewis肺癌小鼠的血清和尿液中分別得到。血管生成抑制素特異作用于內(nèi)皮細胞，它可以抑制內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，并誘導內(nèi)皮細胞凋亡，它通過與細胞表面的受體結合發(fā)揮作用。已發(fā)覺的血管生成抑制素受體：ATP合成酶的α/β、angiomotion和整體聯(lián)蛋白α5β3。2.抗血管生成性抗凝血酶Ⅲ(antiangiogenicantithrombinⅢ，aaAT)探討表明aaAT是切除了羧基端環(huán)的抗凝血酶。aaAT可特異性地抑制內(nèi)皮細胞的增殖，而不作用于其它正常細胞或腫瘤細胞。aaAT對血管生成的抑制作用有劑量依靠性。3.內(nèi)皮細胞抑制素(endostatin)

它可以抑制內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，并誘導內(nèi)皮細胞凋亡。內(nèi)皮細胞抑制素主要的抗血管生成活性是通過抑制內(nèi)皮細胞遷移實現(xiàn)的：它可與內(nèi)皮細胞表面的α5β1整聯(lián)蛋白結合，抑制FAK的激活,進一步影響其下游ERKl／p38MAPK的活化，從而抑制細胞的遷移、影響細胞的存活。內(nèi)皮細胞抑制素還可以誘導內(nèi)皮細胞凋亡。(二)細胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IL-12、IL-18是具有多種功能的調(diào)整性細胞因子，對腫瘤有干脆的抑制作用。近年來的探討發(fā)覺它們也可以通過間接的作用方式抑制血管的生成，來達到抗腫瘤的目的。它們可以通過下調(diào)VEGF和FGF等生長因子的表達水平來發(fā)揮抑制血管生成的活性。白細胞介素-12(IL-12)則是通過提高IFN-γ的表達水平，引致IP-10水平增高來發(fā)揮其抗血管生成的功能。（三）絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serineproteaseinhibitor，Serpin)絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族是由一系列具同源性的蛋白質組成的蛋白質家族。某些Serpin家族成員有抑制血管生成的活性，這些成員包括PEDF(pigmentepithelium-derivedfactor)、maspin、血管驚惶素原等。PEDF是眼內(nèi)最重要的血管生成抑制因子。它抑制血管生成的作用主要是通過誘導內(nèi)皮細胞凋亡實現(xiàn)的，它特異性作用于激活的內(nèi)皮細胞，而不會影響靜止的內(nèi)皮細胞。（四）組織金屬蛋白酶抑制劑(tissueinhibitorofMMP，TIMP)TIMP是體內(nèi)自然存在的金屬蛋白酶抑制物，包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMP在兩個階段對MMP的活性進行抑制。一是在MMP酶原活化階段，TIMP與MMP形成穩(wěn)定的復合物，抑制其自我活化；二是在MMP活化之后，與其依據(jù)1：1的比例結合，對其活性進行抑制。（五）抑癌基因(Tumorsuppressorgene)1.p53p53突變是腫瘤中最常見的基因突變。p53基因編碼的產(chǎn)物P53蛋白是一種轉錄因子，它通過調(diào)整下游靶基因的轉錄，表現(xiàn)出多種生物學功能，其中之一是抑制血管生成。P53的靶基因中包括多種調(diào)整細胞周期和細胞凋亡的基因，它通過激活這些基因的轉錄，導致內(nèi)皮細胞生長周期停滯并促進內(nèi)皮細胞的凋亡。P53還通過影響血管生成調(diào)整因子VEGF的水平抑制血管生成。2.VHLVHL綜合征(vonHippel-Lindaudisease)是一種以多個器官發(fā)生腫瘤為特征的遺傳性疾病，它的致病緣由是VHL抑癌基因的種系突變。與VHL綜合征相關的腫瘤，如視網(wǎng)膜血管瘤、小腦血管瘤、脊柱血管瘤等都是高度血管化的腫瘤。靶向阻斷小鼠肝臟的VHL基因，會導致小鼠肝實質血管化程度加強。這些現(xiàn)象提示我們，VHL可能有抑制血管生成的作用。3.PTEN探討發(fā)覺PTEN可以下調(diào)血管生成因子VEGF的表達，這一結果說明PTEN有抑制血管生成的作用。第四節(jié)抗血管生成療法在腫瘤治療中的應用血管生成是腫瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病、風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、慢性炎癥等血管增生性疾病的重要病理特征，抑制血管的生成對這些疾病的治療有重要的意義。Fo1kman在1971年提出血管生成與腫瘤的生長和轉移親密相關，可以通過抑制腫瘤的血管生成達到治療腫瘤的目的。在腫瘤生長的最初階段，腫瘤細胞可以通過擴散的方式吸取養(yǎng)分。但腫瘤的體積達到2-3mm3時，由于缺乏足夠的養(yǎng)分和氧氣，其生長受到限制，此時腫瘤細胞的增殖和死亡達到平衡，腫瘤處于休眠狀態(tài)，幾乎不會發(fā)生轉移，這種狀態(tài)可能維持長達數(shù)年之久。此后，在某些因素(缺氧、癌基因)的誘導下，血管生成因子處于上調(diào)狀態(tài)，并且(或者)血管生成抑制因子處于下調(diào)狀態(tài)，打破了兩者之間的動態(tài)平衡，使得血管生成機制處于開啟狀態(tài)，起先血管生成的過程。新生血管為腫瘤的接著增殖供應了足夠的氧氣和養(yǎng)分物質，使腫瘤得以快速生長。絕大多數(shù)實體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的生長都須要有血管的生成。原發(fā)瘤的血管生成過程也為腫瘤細胞進人血液循環(huán)，轉移到其它器官供應了機會，因此血管生成不僅是腫瘤生長的前提條件，也是促進腫瘤轉移的重要因素。與傳統(tǒng)的以腫瘤細胞為靶點的治療方法(放療、化療)相比，血管生成抑制劑以腫瘤血管內(nèi)皮細胞為靶點，具有低毒、廣譜及不易產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點。一、血管生成抑制劑在腫瘤治療中的應用近年來以血管為靶點治療腫瘤成為腫瘤探討的熱點之一，血管生成過程的各個環(huán)節(jié)都可能成為抗血管生成的潛在靶點。腫瘤的血管生成受到多種血管生成因子的調(diào)控，VEGF是其中作用最強、專屬性最高的血管生成因子，這使它成為抗血管生成藥物探討的熱點之一。目前有多種針對VEGF、VEGFR及其信號轉導途徑的藥物在探討之中，此外還開發(fā)了多種針對其它生長因子及MMP的小分子藥物，其中某些已進入臨床試驗階段。二、內(nèi)源性血管生成抑制因子在腫瘤治療中的應用目前已進入臨床試驗階段的內(nèi)源性血管生成抑制因子包括血管生成抑制素、內(nèi)皮細胞抑制素等。以內(nèi)皮細胞抑制素為例:在以Lewis肺癌小鼠為模型的體內(nèi)抑癌試驗中，內(nèi)皮細胞抑制素使腫瘤完全消退的劑量是20mg／kg／d，而血管生成抑制素的用量則高達100mg／kg／d。內(nèi)皮細胞抑制素的高效抑瘤活性使它成為第一個進入臨床試驗的此類血管生成抑制因子。接受注射重組血管生成抑制因子的方式治療腫瘤存在某些局限性(需長期用藥、重復注射、用量高、成本高、蛋白不易獲得)，所以接受血管生成抑制因子進行基因治療的方式越來越受到重視。接受基因療法治療腫瘤，基因可在體內(nèi)長期表達、不需在短期內(nèi)頻繁注射、藥物用量少、成本低，較蛋白療法有更大的應用潛力。有人將帶有內(nèi)皮細胞抑制素基因的質粒載體對小鼠進行肌肉注射，視察到血清內(nèi)皮細胞抑制素水平上升，小鼠腦轉移腫瘤生長顯著減慢。三、抗血管生成療法的發(fā)展趨向雖然已經(jīng)有數(shù)種血管生成抑制劑進入了臨床試驗階段，但它們在人體試驗中所顯示的抑瘤效果并不如動物試驗所顯示的結果志向，這說明體內(nèi)特殊是腫瘤的血管生成過程是一個有多種因素參與、多條信號通路調(diào)控的極其困難的過程，單獨運用某種血管生成抑制因子或是阻斷與血管生成相關的某條信號通路并不能完全阻斷血管的生成。假如可以嘗試將幾種作用機制不同的血管生成抑制因子(如血管生成抑制素與內(nèi)皮細胞抑制素)聯(lián)合應用，應當會取得較單獨運用一種因子更好的效果。此外，抑制腫瘤的血管生成，可以增加腫瘤細胞對放化療的敏感性，因此將抗血管生成療法與放化療聯(lián)合應用，有望取得更好的治療效果。Folkman的理論為腫瘤的治療開拓了一條嶄新的道路：抑制腫瘤的血管生成，阻斷腫瘤的養(yǎng)分供應，可導致腫瘤的萎縮、退化；同時，抑制腫瘤新生血管生成，還可以阻斷腫瘤的血道轉移，抑制轉移瘤的生長。用血管生成抑制劑治療腫瘤具有高效、低毒的特點，不易產(chǎn)生耐藥性，還可以增加放療、化療的效果，削減放、化療的劑量，降低毒性。因此，抗血管生成療法在腫瘤的治療中有廣袤的應用前景。第五節(jié)腫瘤血管生成常用探討方法

第一部分體外試驗其次部分體內(nèi)試驗第三部分整體試驗第一部分體外試驗1.血管內(nèi)皮細胞分別培育方法2.內(nèi)皮細胞增殖試驗3.胎盤血管培育試驗4.腫瘤微血管密度計數(shù)5.連續(xù)切片三維重建6.微血管鑄型法7.掃描共聚焦顯微鏡三維重建8.血管內(nèi)皮遷移試驗9.小管形成試驗10.器官培育測定試驗其次部分體內(nèi)試驗1.雞胚絨毛尿囊膜試驗2.角膜微囊試驗3.海綿植入試驗4.圓盤血管生成系統(tǒng)5.基質膠栓試驗6.海綿-基質膠試驗第三部分整體試驗1.斑馬魚試驗模型2.爪蟾蝌蚪試驗模型3.腫瘤模型第一部分體外試驗1.血管內(nèi)皮細胞分別培育方法微血管內(nèi)皮細胞分別方法主要有3種，包括酶消化法、機械分別法和磁珠分別法，最常用的是酶消化法。酶消化法的優(yōu)點是分別的細胞多，純度較高，缺點是酶對某些表面蛋白有破壞作用；后兩種方法可以避開酶對內(nèi)皮細胞的損傷，缺點是其他細胞的污染可能性較大。（下面以酶消化法為例）第一步分別血管內(nèi)皮細胞的分別是將剪碎的組織浸泡在消化酶中，因酶的消化一般是由外向里，所以最終被消化下來的細胞才是內(nèi)皮細胞。因此，徹底地消化組織是獲得足夠微血管內(nèi)皮細胞的前提，且非血管內(nèi)皮細胞的污染是不行避開的。為了能分別獲得足夠的微血管內(nèi)皮細胞，接受過量的酶消化是必要的。其次步細胞的純化血管內(nèi)皮細胞的分別過程中必定伴隨非血管內(nèi)皮細胞的污染，因此血管內(nèi)皮細胞的純化是確定血管內(nèi)皮細胞培育成功與否的關鍵，也是血管內(nèi)皮細胞培育的技術難度所在。目前已經(jīng)建立了多種微血管內(nèi)皮細胞純化的方法。血管內(nèi)皮細胞純化的方法主要有：1.用尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)篩過濾細胞懸液、2.物理刮除法、3.生長特性選擇法、4.局部消化法、5.差速黏附法、6.免疫磁珠法等，可以依據(jù)不同細胞的培育特性或生物特性選擇其中幾種方法進行純化。第三步內(nèi)皮細胞的鑒定目前為止，還沒有發(fā)覺不同器官組織的血管內(nèi)皮細胞具有共同的特異蛋白或標記。因此，血管內(nèi)皮細胞的鑒定大多是依據(jù)器官和組織的起源，從形態(tài)、表型、生化和功能等方面進行綜合評價。血管內(nèi)皮細胞一般呈單層生長，有接觸抑制現(xiàn)象，呈典型的鋪路石狀，電鏡下可以看到Weibel-Palade小體。其表面可以表達CD31、CD34、凝血調(diào)整蛋白和第Ⅷ因子等，可以攝取低密度脂蛋白，產(chǎn)生前列腺素(PGI2和PGE2)，表達E-選擇素，內(nèi)吞功能，結合植物血凝素，形成毛細血管樣網(wǎng)絡。不管利用那種方法，培育的內(nèi)皮細胞都可依據(jù)某些特征進行鑒定。內(nèi)皮細胞可以利用其表面表達血管驚惶素合成酶、攝取乙?；兔芏戎鞍准暗冖蜃拥谋磉_進行鑒定。內(nèi)皮細胞在培育條件下可以形成管形，像原始血管形成或損傷后血管再生，這被認為是內(nèi)皮細胞獨有的特征。但有報道說培育的上皮也可以形成管形。因此，一般狀況下探討者們接受最有利的方法獲得高純度的內(nèi)皮細胞，并用多種方法進行鑒定。血管內(nèi)皮細胞的培育要點依據(jù)血管內(nèi)皮細胞的生長特性，須要接受一些特殊的培育條件，并且這些培育條件可能因為血管內(nèi)皮細胞的起源不同而有所差異。血管內(nèi)皮細胞的培育一般選用DMEM、M199等基礎培育基，pH7.2，添加150mL/L～200mL/L的胎牛血清、1000單位/mL雙抗，20g/L谷氨酰氨，還需添加內(nèi)皮細胞生長因子(一般添加濃度為1%)。依據(jù)其接觸抑制現(xiàn)象需剛好進行傳代培育。2.內(nèi)皮細胞增殖試驗2.1內(nèi)皮細胞增殖檢測血管內(nèi)皮細胞的增殖是血管發(fā)生的重要步驟。目前,已有多種成熟的細胞增殖測定方法,如四氮唑鹽還原法和[3H]-胸腺嘧啶摻入法等細胞增殖測定方法。2.1.1四氮唑鹽還原法(又稱MTT比色法)是一種最常用的檢測細胞存活和生長的方法?；罴毎€粒體中的琥珀酸脫氫酶使外源性MTT還原為藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。MTT結晶形成量與細胞數(shù)成正比。該方法已被用于檢測內(nèi)皮細胞增殖,并廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。2.1.2[3H]-胸腺嘧啶摻入法

是一種更好的測定細胞增殖的方法。將同位素氚標記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)作為DNA合成的前體摻入到增殖細胞中,通過放射自顯影視察細胞增殖狀況。2.2血管生成調(diào)控因子（生長/抑制因子）的檢測血管生成調(diào)控因子很多，但多數(shù)都是蛋白質，依據(jù)試驗條件和須要可以從核酸水平或蛋白質水平進行檢測:2.2.1血管生長（抑制）因子核酸水平檢測RT-PCR檢測血管生長（抑制）因子的mRNA表達：是以RNA為起始膜板產(chǎn)生cDNA,再以cDNA為膜板進行PCR擴增，獲得目的基因或檢測基因表達。（略）

2.2.2血管生長（抑制）因子蛋白質水平檢測2.2.2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）定義：用酶標記抗原或抗體檢測液體（血液、細胞液）中未知抗體或抗原的方法。用于檢測體液中的血管內(nèi)皮生長（抑制）因子。分類：間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標記二抗檢測液相中未知抗體雙抗體夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標記一抗檢測液相中的可溶性抗原競爭法（CompetitiveELISA)

：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標記抗原或抗體檢測液相中的可溶性抗原或抗體2.2.2.2免疫組織化學/免疫熒光標記（定位或半定量）免疫組織化學（略）免疫熒光組織化學原理：依據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，熒光素受激發(fā)光的照射，由低能態(tài)進入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的低能態(tài)，這時發(fā)出光明的熒光（黃綠色或橘紅色），用熒光顯微鏡可見熒光所在的組織或細胞，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及用定量技術測定含量。2.2.2.3免疫印記（Westernblot）基本原理:免疫印跡又稱Western印跡(Western

blot)，與DNA的Southern印跡技術相對應，兩種技術均把電泳分別的組分從凝膠轉移至一種固相載體(通常為NC膜)，然后用探針檢測特異性組分。不同的是，Westernblot所檢測的是抗原類蛋白質成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原發(fā)生特異性反應。該技術結合了凝膠電泳辨別力高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點，具有從困難混合物中對特定抗原進行鑒別和定量檢測，以及從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性。該技術的靈敏度能達到標準的固相放射免疫分析的水平而無需對靶蛋白進行放射性標記。Westernblot的過程分四階段:a.蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測定b.SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）c.蛋白質的電轉移(轉膜)d.靶蛋白的免疫學檢測(雜交)2.2.2.4流式細胞儀檢測流式細胞儀檢測范圍細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質含量細胞結構特異性抗原（細胞表面/胞漿/核）細胞內(nèi)細胞因子細胞活性酶活性激素結合位點細胞受體細胞功能定性和定位免疫組織化學/免疫熒光標記定量ELISA、Westernblot及流式細胞儀檢測

3.胎盤血管培育試驗特點：該試驗模型不須要加外源性生長因子，該模型是篩選人類血管生成潛在激活增加因子和抑制因子行之有效的體外試驗模型。試驗步驟：（1）從剖腹產(chǎn)手術24小時之內(nèi)的人胎盤頂端表面截取約長2～5cm，直徑為l～2mm的表淺血管，洗去血污，浸入Hank平衡鹽溶液中。

（2）將血管培育在48孔培育板中，可在孔中分別加入各種血管生成因子，再加l99培育基，將血管片段在凝固前快速加入培育孔中心，志向的是使血管片段懸浮于培育膠中。（3）然后將培育板置37℃保濕孵育培育14～21天，每周換培育基2次。（4）用減數(shù)成像系統(tǒng)計算原來血管條生成的血管索數(shù)量，每隔一天計數(shù)新生長形成的微血管條數(shù)，由此描繪微血管生長曲線。（5）用免疫組化、流式細胞儀、電鏡等分別檢測了CD34，Weibel-Palade小體標記物等，證明新生血管中含有內(nèi)皮細胞。

4.腫瘤微血管密度計數(shù)(MVD)用CD31或CD34等抗體在組織切片上對血管內(nèi)皮細胞進行免疫組織化學標記,血管內(nèi)皮細胞質呈棕黃色。MVD計數(shù)：先在低倍視野內(nèi)找到微血管密度最高的區(qū)域，然后在高倍視野內(nèi)計數(shù)微血管的數(shù)目。辨別不清或染色模糊的細胞不計入結果，單個的棕黃色內(nèi)皮細胞或細胞簇作一個血管計數(shù)，但肌層較厚及血管腔面積>8個紅細胞直徑的血管不計數(shù)。計5個視野的MVD，取其平均值作為MVD。MVD可以作為腫瘤血管生成的形態(tài)學指標，提示腫瘤生長、侵襲和轉移潛能。

5.連續(xù)切片三維重建法物體切片二維參數(shù)為人們供應了物體某一截面的二維信息。假如將物體不同截面上的二維圖像依據(jù)截面的空間關系依次排列，便可組成物體的三維數(shù)據(jù)。連續(xù)切片的計算機三維重建技術是對某一結構進行連續(xù)超薄切片，然后把這一系列切片的圖像，通過計算機進行處理，從而得到該結構的立體形態(tài)的一種方法。在利用計算機圖像處理理論、圖形生成理論以及視覺心理學，在二維平面上形象地顯示物體的三維圖像，這就是計算機三維重建過程。該技術包括：1.連續(xù)切片技術2.二維圖像的處理技術3.三維重建技術6.微血管鑄型法原理：將鑄型材料（聚甲基丙烯酸甲酯）灌注到動物體內(nèi)（生前經(jīng)左心室插入導管至升主動脈），灌注12-24小時后處死動物，10%福爾馬林固定2-3天后，用24%鹽酸腐蝕掉組織（留下血管），離子鍍膜機鍍金，掃描電鏡下視察微血管狀況。微血管鑄型材料接受聚甲基丙烯酸甲酯。聚甲基丙烯酸甲酯是一種高分子合成樹酯,它是由甲基丙烯酸甲酯通過聚合反應生成,單體是液態(tài),聚合體是固態(tài)。聚合反應過程分為引發(fā)、發(fā)展和終止階段。單體加入引發(fā)劑后,產(chǎn)生活化中心,即為引發(fā)階段放射性骨壞死邊緣的微血管鑄型圖7.激光掃描共聚焦顯微鏡三維重建法激光掃描共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡成像基礎上加裝了激光掃描裝置，利用計算機進行圖像處理，把光學成像的辨別率提高了30%~40%，運用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結構的熒光圖像，在亞細胞水平上視察諸如Ca2+、pH值，膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變更，成為形態(tài)學，分子生物學，神經(jīng)科學，藥理學，遺傳學等領域中新一代強有力的探討工具。激光共聚焦成像系統(tǒng)能夠用于視察各種染色、非染色和熒光標記的組織和細胞等，能夠進行活體細胞中離子和PH值變更探討，神經(jīng)遞質探討，熒光原位雜交探討（FISH），細胞骨架探討，基因定位探討，原位實時PCR產(chǎn)物分析，熒光漂白復原探討（FRAP），胞間通訊探討，蛋白質間探討，膜電位與膜流淌性等探討，完成圖像分析和三維重建等分析。

共聚焦顯微鏡的辨別率超過一般光學顯微鏡，染色過程簡便，可以在活細胞上進行無創(chuàng)傷性的染色，最大程度地維持細胞的正常形態(tài)。多種自發(fā)性的熒光染料，已被廣泛地用于諸如RNA、DNA細胞核、線粒體、內(nèi)質網(wǎng)、肌動蛋白、細胞膜等結構的標記。運用免疫熒光技術，將不同波長的兩三種熒光物質標記在內(nèi)部不同結構的相應抗體上，以這幾種熒光物質特定的光譜特性選擇激發(fā)光和濾光片，則可以視察到細胞內(nèi)部各結構間的毗鄰關系。共聚焦顯微鏡生成厚度小于0.2微米的依次相連的光學切片，即使較厚的組織的三維數(shù)據(jù)也可被計算機獲得，運用適當?shù)膱D像分析軟件，可以測量并確定所視察結構的表面特征，體積等參數(shù)，為相互結合定量測量供應了新手段。

激光掃描共聚焦顯微鏡可以將各層面的微血管圖像進行三維重建和處理。從而，可以分析微血管的三維立體特征及其空間關系。8.血管內(nèi)皮遷移試驗目前，對血管內(nèi)皮細胞遷移的影響，已經(jīng)有很多有效的測定方法。其中以改良的BoydenChamber或Transwell法最常用。這些方法均是通過觀測穿過確定孔徑(如8μm)硝酸纖維素薄膜的細胞數(shù)量,確定細胞遷移實力。8.1BoydenChamber試驗:Boyden室由兩層組成,兩層之間為膠原包被的多孔的多聚碳酸鹽濾膜;血管內(nèi)皮細胞放于上層,同時加入待測藥物,共同培育6h后,除去上層的細胞,下層細胞用甲醇固定,HE染色,光鏡下計算下層的血管內(nèi)皮細胞數(shù)。該方法優(yōu)點在于它對藥物濃度梯度差異很敏感。但對試驗技術要求較高且計數(shù)方法不同可能會造成統(tǒng)計結果誤差較大。因此有必要建立一個嚴格的計數(shù)標準以削減因方法不同產(chǎn)生的誤差。8.2Transwell試驗：這項技術的主要材料是Transwell小室，其外形為一個可放置在孔板里的小杯子，依據(jù)試驗須要，可有不同選擇。其關鍵部分都是一樣的，那就是杯子底層的一張有通透性的膜，而杯子其余部分的材料與一般的孔板是一樣。這層膜帶有微孔，孔徑大小有0.1－12.0微米，依據(jù)不同須要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜。將Transwell小室放入培育板中，小室內(nèi)稱上室，培育板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培育液，下室內(nèi)盛裝下層培育液，上下層培育液以聚碳酸酯膜相隔。將細胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培育液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，從而可以探討下層培育液中的成分對細胞生長、運動等的影響。應用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培育、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的探討。

8.3劃痕損傷試驗：在國外出現(xiàn)較早。用移液器滴頭或刀片在單層血管內(nèi)皮細胞的培育皿上劃痕，為邊緣內(nèi)皮細胞遷移供應一袒露區(qū)域。經(jīng)過創(chuàng)傷后邊緣的單層內(nèi)皮細胞可遷移至創(chuàng)傷區(qū)域，并重新形成新的單層內(nèi)皮細胞層。在光鏡下計數(shù)從損傷邊緣遷移出的細胞數(shù)和遷移的相對距離，并計算出細胞的實際遷移距離。然而這種方法的定量具有隨意性。9.小管形成試驗小管形成試驗能模擬人體內(nèi)毛細血管生成的過程,包括內(nèi)皮細胞出芽增殖和毛細血管網(wǎng)結構形成等步驟,接近人體內(nèi)血管生成的實際過程。內(nèi)皮細胞在基質膠、纖維蛋白膠、膠原等基質上培育時能形成網(wǎng)狀結構。用電子顯微鏡來分析小管間的緊密連接,從而定量血管生成狀況。試驗一般接受24孔培育板,但它底面積大，Matrigel用量多,計數(shù)區(qū)域大只能隨機選擇幾個典型區(qū)域且數(shù)據(jù)分析耗時長。Sanz等接受384孔和536孔培育板培育可節(jié)約膠的用量,借助計算機可以計算整個孔的小管及小管之間的連接數(shù)及小管的長度和面積。改進方法后削減了原來分析困難及重現(xiàn)性差的缺點。10.器官培育測定試驗器官培育試驗極大地推動了對血管形成的測定。器官血管形成測定法包括鼠主動脈環(huán)、雞主動脈弓、豬頸動脈、胎兒鼠骨移植測定法等。這些測定法特別相像，其中鼠主動脈環(huán)測定應用最為廣泛。取下大鼠主動脈后,剪成1mm寬的血管環(huán),再用纖維蛋白膠或膠原蛋白膠包埋,然后以無血清的MCDB131培育液培育。培育過程中每天計算主動脈環(huán)產(chǎn)生的新生微血管數(shù)并進行定量分析。用不同膠培育的大鼠主動脈環(huán)新生血管的生長曲線不同。膠原包埋的主動脈環(huán),培育1周時血管數(shù)達到頂峰,第2周起先萎縮。2002年有人將此方法改進,接受更薄的膠層包埋動脈環(huán)使得新生成血管染色更便利;應用雙重染色法和共聚焦顯微鏡在同一層面上視察到內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞及外周細胞共同存在并證明白新生血管主要由內(nèi)皮細胞構成。動脈環(huán)取材范圍廣泛,視察方法簡潔,可從分子水平闡明血管生長的分子調(diào)控機制,是一個較好的體外血管生成模型。其次部分體內(nèi)試驗1.雞胚絨毛尿囊膜試驗2.角膜微囊試驗3.海綿植入試驗4.圓盤血管生成系統(tǒng)5.基質膠栓試驗6.海綿-基質膠試驗1.雞胚絨毛尿囊膜試驗(CAM)特點：1.方法簡便且成本低，儀器設備條件要求不高；2.易于操作，便于推廣；3.可用于進行大樣本探討，4.可用于影響血管生成因素或藥物的篩選和評價。雞胚絨毛尿囊膜(CAM)試驗主要步驟：(1)．雞胚準備和接種組織：(2)組織接種：

(3)接種組織的收獲與視察：CAM血管生成試驗模型的用途：①檢測評價接種物刺激CAM血管增生的血管生成作用，用于分析探討血管生成促進因子、抑制因子的活性和作用的檢測，如腫瘤血管生成的探討等；②對接種物，如腫瘤組織、自身的血管生成進行探討，用于分析不同組織的血管生成活性和作用，如腫瘤組織有引發(fā)新生血管生成的作用。比照抗血管生成藥物作用以后2.角膜微囊試驗1.動物模型：4～6周齡雄性裸小鼠。在手術顯微鏡下，裸鼠角膜建立一個1.5mm×0.8mm大小的微囊。將腫瘤組織切成0.3mm3小塊，然后接種于微囊中，建立裸鼠角膜微囊移植模型。2.試驗分組：分處理組和比照組。3.角膜新生血管的視察與定量探討：手術后第3、5、7、9、12、15、18、21d，應用體視顯微鏡，動態(tài)視察角膜微囊內(nèi)腫瘤誘導的血管生成狀況，顯微數(shù)碼攝像系統(tǒng)記錄視察結果。依據(jù)新生血管的數(shù)目及生長速度確定新生血管的活性。依據(jù)Ziche法定量計算角膜新生血管的積分，即新生血管積分=血管密度×血管長度。血管密度指數(shù)1相當于0～25條血管/角膜、2相當于25～50條血管/角膜、3相當于50～75條血管/角膜、4相當于75～100條血管/角膜、5相當于>100條血管/角膜。將角鞏膜緣到角膜中心（瞳孔）的距離分成5等份，以圓周到圓心的距離為5，計算新生血管長度。3.海綿植入試驗1