細(xì)菌的培養(yǎng)及鑒定思路

關(guān)于細(xì)菌的培養(yǎng)及鑒定思路第1頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五標(biāo)本采集原則1.及時采集微生物標(biāo)本作病原學(xué)檢查2.在抗菌藥物使用前采集標(biāo)本3.采樣時嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作4.標(biāo)本容器須無菌，但不得有消毒劑5.采樣后立即送檢6.送檢標(biāo)本應(yīng)注明來源和檢驗(yàn)?zāi)康牡?頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五咳痰方法病人先漱口，清潔口腔，去除表面的菌群病人深咳，收集從下呼吸道咳出的痰液無痰可用3％～5％NaCl5ml霧吸約5min導(dǎo)痰以清晨第二口痰為佳標(biāo)本采集后放置時間不超過2小時

第3頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五清潔中段尿液盡量取早晨第一次尿液囑患者留取標(biāo)本的前一天晚上少飲水女性病人收集標(biāo)本前用肥皂水沖洗外陰，再以滅菌清水沖洗尿道口排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人翻轉(zhuǎn)包皮，清洗尿道口排出幾毫升后，不停止尿流,采集中段尿

采集標(biāo)本后立即送檢！第4頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五標(biāo)本接收原則嚴(yán)格實(shí)行核對制度：包括姓名、性別、年齡、門診號/住院號、病床號、標(biāo)本類型、容器、標(biāo)識、檢驗(yàn)?zāi)康牡?。所有拒收或退回?biāo)本均應(yīng)在登記本上登

記，登記內(nèi)容包括：病人姓名、病區(qū)、床號

送檢醫(yī)師、送檢項(xiàng)目、拒收(退回)原因、拒收時間、經(jīng)手人等第5頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五痰標(biāo)本涂片染色低倍鏡下分類分級白細(xì)胞（個）上皮細(xì)胞（個）A>25<10B>25<25C<10>25A、B兩種情況的痰適合做培養(yǎng)，C不合格，應(yīng)重新留標(biāo)本第6頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五哥倫比亞血平板—營養(yǎng)要求高的細(xì)菌巧克力平板—含V、X因子，主要培養(yǎng)嗜血桿菌、腦膜炎球菌和淋球菌用中國藍(lán)/麥康凱平板—G-桿菌用SS平板—沙門氏菌和志賀氏菌用M-H平板—細(xì)菌藥敏用TCBS平板—弧菌科細(xì)菌用沙包氏平板—真菌培養(yǎng)用真菌顯色平板—真菌培養(yǎng)用羅氏培養(yǎng)基—分枝桿菌用常用的培養(yǎng)基種類和用途第7頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五接種工具接種針和接種環(huán)：由三部分組成，即環(huán)（針）、金屬柄和絕緣柄接種針：用于穿刺接種細(xì)菌接種環(huán)：用于固體、液體培養(yǎng)基的細(xì)菌接種第8頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五器具：接種環(huán)（上）和接種針（下）

柄約22cm2—5cm絕緣柄約7.5cm金屬柄約14.5cm5—8cm安裝環(huán)(針)的螺口(約8mm)第9頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五操作原則：無菌操作（燒灼滅菌）Asepticarea10-20cm外焰焰芯內(nèi)焰第10頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌接種的基本程序滅菌接種環(huán)沾取標(biāo)本接種滅菌接種環(huán)殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染環(huán)境第11頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌接種法平板劃線接種法：

★目的：使混合的細(xì)菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌。

★方法：★分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本★連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本液體培養(yǎng)基接種法穿刺接種法:用于觀察細(xì)菌動力斜面接種法傾注培養(yǎng)法:用于細(xì)菌計(jì)數(shù)第12頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五分區(qū)劃線法(3區(qū))第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第13頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五連續(xù)劃線法第14頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第15頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌培養(yǎng)法一般培養(yǎng)（需氧培養(yǎng)）：★培養(yǎng)溫度：35℃（采用恒溫培養(yǎng)箱）★培養(yǎng)時間：18～24h二氧化碳培養(yǎng)法：燭缸法、二氧化碳培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)法：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋、厭氧罐、皰肉培養(yǎng)法、硫乙醇酸鹽法等第16頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌落★定義：指單個細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上生長繁殖，形成單一肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)?！锞涮卣鳎捍笮?、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性★菌落類型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）菌苔：指多個菌落融合在一起形成的細(xì)菌堆積物。第17頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五菌落第18頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五菌落與菌苔第19頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五菌落的三個類型：

1.光滑型菌落（SmoothtypeColony）：又稱S型2.粗糙型菌落（RoughtypeColony）：又稱R型3.粘液型菌落（MucoidtypeColony）又稱M型第20頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五2023/3/621S型菌落第21頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五R型菌落第22頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五M型菌落第23頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象混濁沉淀：多見于鏈狀排列的細(xì)菌菌膜：多見于厭氧菌第24頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：第25頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有鞭毛細(xì)菌：在培養(yǎng)基中沿穿刺線并向外擴(kuò)散生長，穿刺線邊緣模糊。無鞭毛細(xì)菌：只沿穿刺線生長，穿刺線邊緣清晰。第26頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有動力現(xiàn)象無動力現(xiàn)象第27頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五斜面接種法第28頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五接種斜面后菌落生長示意圖（菌苔）第29頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五革蘭染色原理：通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)復(fù)紅等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。第30頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五

革蘭染色步驟

涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定第31頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五固定的目的：使細(xì)菌的細(xì)胞凝固，使菌體與玻片粘得更牢固；可改變菌體對染料的通透性；加熱固定可殺死細(xì)菌，比較安全。第32頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五

結(jié)晶紫1’碘液1’

95%乙醇

30”復(fù)紅1’

沖洗濾紙干燥

油鏡觀察沖洗沖洗沖洗革蘭染色程序初染媒染脫色復(fù)染第33頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五紫色（G＋）革蘭氏染色步驟示意圖革蘭染色甲菌乙菌初染結(jié)晶紫媒染碘液脫色乙醇復(fù)染稀釋復(fù)紅紫色（G＋）紅色（G-）革蘭染色步驟示意圖第34頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五【結(jié)果】細(xì)菌被染成紫色者，稱為革蘭陽性菌；而細(xì)菌染成紅色者，稱為革蘭陰性菌；陽性菌——紫色（G+b)

陰性菌——紅色（G-b)第35頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五G+

球菌第36頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五顯微鏡下的桿菌G-桿菌Figure2-GramstainofGram-E.colicells第37頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五革蘭染色注意事項(xiàng)標(biāo)本涂片不宜太厚固定不宜過熱脫色不宜過度選用培養(yǎng)18--24小時菌齡的細(xì)菌為宜第38頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五抗酸染色原理：分枝桿菌細(xì)胞壁含脂質(zhì)較多,其中主要成分為分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色時與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固,能抵抗酸性乙醇的脫色作用,因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色,達(dá)到染色目的。第39頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五

抗酸染色步驟

1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定第40頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五抗酸染色步驟2、染色包括初染、脫色、復(fù)染三步。

石炭酸復(fù)紅維持3-5’3%鹽酸酒精30’’

~1’美藍(lán)復(fù)染1’

沖洗干燥

油鏡觀察沖洗沖洗初染脫色復(fù)染第41頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五抗酸染色結(jié)果抗酸菌呈紅色，常堆積成團(tuán)，排列無序，偶呈分枝狀生長。背景及非抗酸性細(xì)菌呈蘭色。第42頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五抗酸染色注意事項(xiàng)為防止交叉感染，標(biāo)本先高壓滅菌后再涂片染色染色充分脫色時間寧長勿短在涂抹痰標(biāo)本時嚴(yán)禁對載玻片進(jìn)行加熱第43頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五臨床標(biāo)本培養(yǎng)基選擇血：血培養(yǎng)瓶中斷尿：血平板、mac平板腦脊液：血培養(yǎng)瓶、血平板、巧克力平板穿刺液：血培養(yǎng)瓶、血平板、巧克力平板、mac平板膽汁：血平板、巧克力平板、mac平板大便:.麥康凱、SS、血平板第44頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五臨床標(biāo)本培養(yǎng)基選擇生殖道標(biāo)本根據(jù)臨床醫(yī)生所寫的檢驗(yàn)項(xiàng)目接種相應(yīng)的平板及操作：

淋球菌培養(yǎng)接種淋球菌平板;念珠菌培養(yǎng)接種沙保羅培養(yǎng)基；支原體培養(yǎng)則按《支原體培養(yǎng)的操作規(guī)程》操作；作普通培養(yǎng)則接種血平板和巧克力平板

第45頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五觀察細(xì)菌在平板上的生長現(xiàn)象血平板：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性mac平板：大小、形狀、顏色、透明度、濕潤度、黏度巧克力平板：大小、形狀、顏色、透明度、濕潤度、黏度第46頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五無菌部位標(biāo)本第47頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五2023/3/648

革蘭陰性菌葡萄球菌第48頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五痰培養(yǎng)真菌、鏈球菌菌落形態(tài)第49頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌的初步分類細(xì)菌的分離與純化：自血平板挑出待檢菌株的單菌落進(jìn)行初步的鑒定。如果混有雜菌，應(yīng)該重新轉(zhuǎn)種分純。染色與鏡檢：首先通過革蘭氏染色確定基本的分類：（1）G+球菌（2）G-球菌（3）G-桿菌（4）G+桿菌。此外，如果鏡下發(fā)現(xiàn)革蘭氏染色陽性、橢圓形、有芽孢狀的較大菌體，可能是真菌。第50頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌的初步分類觸酶試驗(yàn)

主要用于G+球菌的分類。葡萄球菌屬（微球菌屬）：觸酶（+），鏈球菌屬及腸球菌：觸酶（-）氧化發(fā)酵試驗(yàn)（O/F試驗(yàn)）根據(jù)細(xì)菌在無氧環(huán)境中能否利用碳源將細(xì)菌分為非發(fā)酵菌(O/F陰性)和發(fā)酵菌（O/F陽性）氧化酶試驗(yàn)：腸桿菌的氧化酶（-），非發(fā)酵菌多數(shù)氧化酶（+），但嗜麥芽窄食單胞菌和不動桿菌的氧化酶（-），弧菌科氧化酶（+）第51頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五G-桿菌的鑒定途徑G染色G-b

O/F試驗(yàn)和氧化酶（ox)試驗(yàn)

OF（-）

OF（+）

OF（+）ox（+）

ox（-）

ox（+）

非發(fā)酵型細(xì)菌腸桿菌科

弧菌科第52頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五G-桿菌ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)腸桿菌科、弧菌科ID32E腸桿菌科鑒定條ATBG-5腸桿菌科藥敏試條非發(fā)酵菌ID32GN非發(fā)酵菌鑒定條ATBPSE5非發(fā)酵菌藥敏試條

第53頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五2023/3/654革蘭陰性鑒定及藥敏試條第54頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五血清學(xué)試驗(yàn)?zāi)c道致病菌生化特征符合的前提下必須有血清學(xué)的試驗(yàn)作最后確認(rèn)：

1.志賀氏菌多價和單價凝集血清2.沙門氏菌多價和單價凝集血清3.致病性大腸桿菌多價和單價凝結(jié)血清4.

耶爾森氏菌凝集血清第55頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五G+球菌的鑒定途徑1.首先根據(jù)菌落特點(diǎn)和革蘭氏染色判斷是否為G+球菌。2.根據(jù)觸酶結(jié)果判斷為葡萄球菌（微球菌屬）or鏈球菌（腸球菌）3.葡萄球菌屬：觸酶（+）鏈球菌屬及腸球菌：觸酶（-）第56頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五G+球菌的鑒定途徑葡萄球菌屬：觸酶（+）、氧化酶（-）、

O-F試驗(yàn)：發(fā)酵型

微球菌屬：觸酶（+）、氧化酶（+）、

O-F試驗(yàn)：氧化型第57頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五金黃色葡萄球菌最重要的致病葡萄球菌血平板上菌落有明顯β溶血環(huán)，顏色呈金黃色、灰白色或檸檬色分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇血漿凝固酶和DNA酶陽性

第58頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第59頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五2023/3/660葡萄球菌第60頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)葡萄球菌：ID32STAPH葡萄球菌鑒定條ATBSTAPH5葡萄球菌藥敏試條第61頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五2023/3/662葡萄球菌鑒定、藥敏試條第62頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五鏈球菌鑒定途徑鏈球菌屬:觸酶（-）、七葉苷（-）、6.5%NaCl（-）

腸球菌：觸酶（-）、七葉苷（+）、6.5%NaCl（+）第63頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五鏈球菌鑒定途徑根據(jù)G染色和觸酶結(jié)果確定為鏈球菌，然后再根據(jù)細(xì)菌的溶血情況和菌落特點(diǎn)判斷鑒定途徑第64頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五鏈球菌鑒定途徑根據(jù)G染色和觸酶結(jié)果確定為鏈球菌，然后再根據(jù)細(xì)菌的溶血情況和菌落特點(diǎn)判斷鑒定途徑第65頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第66頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五鏈球菌鑒定途徑

α溶血

Optochin

R

S

+膽汁七葉苷--

肺炎鏈球菌

D群鏈球菌

草綠色鏈球菌

第67頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第68頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五鏈球菌鑒定途徑

β溶血

桿菌肽CAMP膽汁七葉苷

S

+

+

A群鏈球菌

B群鏈球菌

D群鏈球菌6.5%NaCl--+

非腸球菌腸球菌第69頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第70頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五鏈球菌鑒定途徑

γ溶血

膽汁七葉苷

+--D群鏈球菌草綠色鏈球菌-6.5%NaCl+非腸球菌腸球菌

第71頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鏈球菌：RapidID32STREP鏈球菌鑒定條ATBSTREP5鏈球菌藥敏試條

腸球菌：RapidID32STREP鏈球菌鑒定條ATBEnteroc5腸球菌藥敏試條第72頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五G-桿菌的鑒定途徑G染色G-b

O/F試驗(yàn)和氧化酶（ox)試驗(yàn)

OF（-）

OF（+）

OF（+）ox（+）

ox（-）

ox（+）

非發(fā)酵型細(xì)菌腸桿菌科

弧菌科第73頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)腸桿菌科、弧菌科ID32E腸桿菌科鑒定條ATBG-5腸桿菌科藥敏試條非發(fā)酵菌ID32GN非發(fā)酵菌鑒定條ATBPSE5非發(fā)酵菌藥敏試條

第74頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五真菌的鑒定途徑沙包氏培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基革蘭氏染色：陽性、橢圓形、有芽孢狀的較大菌體通過血清芽管形成試驗(yàn)鑒定出白念珠菌CSF標(biāo)本通過墨汁染色可以初步判斷為新型隱球菌第75頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第76頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)酵母樣真菌：ID32C酵母菌鑒定條ATBFUNGUS3酵母菌藥敏條第77頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五嗜血桿菌的鑒定途徑只能在營養(yǎng)條件高的巧克力平板上生長，菌落為中等大小、圓形、灰白色、透明革蘭染色：G-小桿菌衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)就可以幫助初步鑒定第78頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五2023/3/679嗜血桿菌第79頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第80頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)嗜血桿菌：

APINH嗜血桿菌鑒定條

ATBHAEMO嗜血桿菌藥敏試條第81頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五奈瑟氏菌屬鑒定在血平板和巧克力平板上生長，mac上不生長血平板形成灰色、濕潤、透明或半透明、不溶血的菌落巧克力平板上形成圓形、灰藍(lán)色的似露滴狀菌落革蘭染色：G-雙球菌，呈腎形或咖啡豆形，凹面相對氧化酶和觸酶都均為陽性第82頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五

奈瑟氏菌屬有11個種，臨床就淋病奈

菌和腦膜炎奈瑟菌最為重要第83頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五奈瑟氏菌屬鑒定流程

菌落觀察：灰色、濕潤、透明或半透明、不溶血

涂片染色：G-雙球菌，呈腎形或咖啡豆?fàn)?/p>

氧化酶試驗(yàn)+觸酶+

+麥芽糖--

腦膜炎奈瑟菌

淋病奈瑟菌第84頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五莫拉菌有4個種，僅卡他莫拉菌對人類有致病性莫拉菌屬第85頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五卡他莫拉菌鑒定在血平板和巧克力平板上生長，mac上不生長血平板形成灰白色或紅棕色、不溶血的菌落，培養(yǎng)48小時，菌落表面干燥，接種環(huán)可推移整個菌落且不粘環(huán)革蘭染色：G-雙球菌，呈咖啡豆形氧化酶和觸酶都為陽性第86頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五卡他莫拉菌鑒定流程

菌落觀察：灰白色或紅棕色、光滑、不溶血、干燥

涂片染色：G-雙球菌，呈腎形或咖啡豆?fàn)钛趸冈囼?yàn)+觸酶++DNAM酶

--

卡他莫拉菌其他奈瑟氏菌

第87頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五奈瑟氏菌屬與相似菌鑒別的關(guān)鍵性試驗(yàn)

葡萄糖麥芽糖蔗糖硝酸鹽還原DNA酶淋病奈瑟菌+--

------腦膜炎奈瑟菌++------

卡他莫拉菌

------++

第88頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)

奈瑟氏菌屬和莫拉菌鑒定和藥敏試條同

嗜血桿菌

第89頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五需氧G+b的鑒定途徑根據(jù)抗酸染色（A）將其分為：

A+：分枝桿菌、奴卡氏菌

A-：李斯特菌屬，芽胞桿菌屬、棒狀桿菌屬、乳酸桿菌屬、丹毒絲菌屬等第90頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五需氧G+b的鑒定途徑屬間鑒定，通過觸酶和動力試驗(yàn)加以初步確定

觸酶（+）

+

動力

-

李斯特菌屬