高中生物基因工程的基本操作程序新人教版選修

關(guān)于高中生物基因工程的基本操作程序新人教版選修第1頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日一.目的基因的獲取1.基因的結(jié)構(gòu)2.目的基因的概念3.目的基因的獲取的方法第2頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日1.基因的結(jié)構(gòu)（1）原核生物基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼蛋白質(zhì)調(diào)控遺傳信息的表達（調(diào)控程序）…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥G……T‥………TACACGTGCATCAAT………‥C…啟動子終止子第3頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGUUA

啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).

終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。第4頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)（能編碼蛋白質(zhì)）啟動子終止子（2）真核與原核生物基因結(jié)構(gòu)的比較外顯子內(nèi)含子編碼蛋白質(zhì)（不能編碼蛋白質(zhì)）①相同點：都是由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有調(diào)控作用的非編碼區(qū)。②不同點：原核細胞基因的編碼區(qū)是連續(xù)的；真核細胞的編碼區(qū)是間隔的，不連續(xù)的。第5頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日2.目的基因的概念主要是指編碼蛋白質(zhì)基因例如：與生物抗逆性相關(guān)的基因，與生物優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因，藥物和保健品相關(guān)的基因，與毒物降解相關(guān)的基因，以及與工業(yè)所需要酶相關(guān)的基因。

目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細菌)、人胰島素基因等。第6頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日3.目的基因的獲取的方法（4）從已有物種分離出目的基因（3）用化學(xué)方法直接人工合成目的基因（1）從基因庫中獲取目的基因（2）應(yīng)用PCR技術(shù)擴增目的基因第7頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日（1）從基因庫中獲取目的基因①基因文庫和部分基因文庫的慨念②基因組文庫和cDNA文庫的主要區(qū)別③怎樣從基因文庫中找到我們所需要的目的基因第8頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日①基因文庫和部分基因文庫的慨念：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫。

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫。

基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫。如：cDNA文庫。第9頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日基因組文庫的建立方法提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與運載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫方法一：直接分離法(鳥槍法)第10頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日②在細胞質(zhì)中將mRNA分離并加入反轉(zhuǎn)錄酶③合成第二條DNA鏈外顯子內(nèi)含子外顯子外顯子內(nèi)含子真核細胞的基因①在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA②在核內(nèi)內(nèi)含子被切去，外顯子彼此連接③在細胞質(zhì)中將mRNA分離并加入反轉(zhuǎn)錄酶④合成第二條DNA鏈基因的cDNA不含內(nèi)含子mRNA原核細胞的基因①在細胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄第11頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日②基因組文庫和cDNA文庫的主要區(qū)別

文庫類型cDNA文庫

基因組文庫

文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）基因中內(nèi)含子(位于編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）

基因多少

物種間的基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以第12頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日③怎樣從基因文庫中找到我們所需要的目的基因

根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，例如，根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以及基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。第13頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日（2）應(yīng)用PCR技術(shù)擴增目的基因①定義：②原理：DNA復(fù)制PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)，在短時間內(nèi)大量擴增目的基因DNA分子熱變性（在90～95OC時，解旋，雙鏈分開溫度降低又結(jié)合成雙鏈）因此，在PCR技術(shù)中不需要解旋酶（與復(fù)制不同之在處)③儀器：PCR擴增儀（自動調(diào)控溫度的儀器）④條件：有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物，脫氧核苷酸，酶等。第14頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日④過程：a.DNA熱變性（90～95OC)：b.復(fù)性（55～60

OC)

：c.延伸（70～75OC)：d.重復(fù)a.b.c步驟：

雙鏈DNA模板在熱的作用下，氫鍵斷裂形成單鍵DNA

系統(tǒng)溫度降低，引物結(jié)合到互補DNA鏈上，形成局部的雙鏈DNA

在Taq酶作用下，合成與模板互補的DNA子鏈，形成雙鏈DNA

每重復(fù)一次，目的基因增加一倍PCR擴增為指數(shù)形式擴增2n(n為擴增循環(huán)的次數(shù)），在短時間內(nèi)擴增大量目的基因。第15頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日用化學(xué)方法直接人工合成目的基因①反轉(zhuǎn)錄法mRNA→RNA與DNA雜交鏈→單鏈DNA→雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸酶HDNA聚合酶cDNA②化學(xué)合成法氨基酸序列→mRNA序列→目的基因序列→目的基因推測合成思考：

不具有，缺少非編碼區(qū)(啟動子、終止子）和非編碼序列（如內(nèi)含子），要人工構(gòu)建。人工合成的目的基因是否具有完整基因結(jié)構(gòu)的基因？推測第16頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日1.作用：二.基因表達載體的構(gòu)建——核心IMN2.組成：①使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代。②同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用。(3)終止子：是使轉(zhuǎn)錄在需要的地方停止。(4)標(biāo)記基因：是鑒別受體細胞中是否含有目的基因從而將含有目的基因的細胞篩選出來。(2)啟動子：是RNA聚合酶識別和結(jié)合部位。(1)目的基因。（5）復(fù)制原點：是轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的起點。

不同受體細胞，目的基因?qū)胧荏w細胞的方法不同，基因表達載體的構(gòu)建有所差異。第17頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日導(dǎo)入接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基大腸桿菌不含抗四環(huán)素基因證明：不存活含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基證明：大腸桿菌含抗四環(huán)素基因證明：

大腸桿菌的受體細胞含有目的基因

四環(huán)素抗性基因

四環(huán)素抗性基因完全培養(yǎng)基存活如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細胞篩選出來？第18頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日存活的大腸桿菌培養(yǎng)培養(yǎng)質(zhì)粒來源：大腸桿菌含有氨芐青霉素的完全培養(yǎng)基含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基人工改造質(zhì)粒（選擇具有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因農(nóng)桿菌）質(zhì)粒知識拓展第19頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日Hind限制性酶ⅠⅡHindIIIHindIII目的DNA質(zhì)粒構(gòu)建表達載體四環(huán)素抗性基因由于目的基因插入而失活，形成只具有氨芐青霉素抗性基因DNA連接酶人類胰島素的基因第20頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)導(dǎo)入含目的基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌含有氨芐青霉素的完全培養(yǎng)基含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)基均不能生長大腸桿菌Ca2+

處理細胞形成感受態(tài)細胞檢測（培養(yǎng)不具有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性積基因的大腸桿菌）只有氨芐青霉素抗性基因質(zhì)粒只具有氨芐青霉素抗性基因大腸桿菌不具有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性積基因的大腸桿菌完全培養(yǎng)基第21頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日培養(yǎng)檢測含重組質(zhì)粒的大腸桿菌含有氨芐青霉素的完全培養(yǎng)基含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基（大腸桿菌內(nèi)含有氨芐青霉素抗性基因，不含有四環(huán)素抗性基因）只具有氨芐青霉素抗性基因農(nóng)桿菌不存活存活證明：目的基因已導(dǎo)入質(zhì)粒培養(yǎng)培養(yǎng)完全培養(yǎng)基

培育出得到能夠發(fā)酵產(chǎn)生人類胰島素的工程菌。第22頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日尋根問底：

將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，結(jié)果會怎樣？

有人采用總DNA注射法進行遺傳轉(zhuǎn)化：即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體細胞，沒有進行表達載體的構(gòu)建。

這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什么基因?qū)肓耸荏w細胞。此法目前爭議頗多，嚴格來說不算基因工程。第23頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日資料:

科學(xué)家在培育抗蟲棉時，起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。

然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因啟動子，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因終止子，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。

資料證明：載體構(gòu)建組成要完整第24頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1.轉(zhuǎn)化：

目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的工程2.常見轉(zhuǎn)化方法：（1）將目的基因?qū)胛⑸锛毎惺軕B(tài)細胞法。①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：雙子葉植物和裸子植物。（2）將目的基因?qū)胫参锛毎刍驑尫ǎ簡巫尤~植物。②花粉管通道法：雙子葉植物。顯微注射法。（3）將目的基因?qū)雱游锛毎?5頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日③常用法：②常用菌：①微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少④過程：大腸桿菌Ca2+處理獲得感受態(tài)細胞Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA___感受態(tài)細胞法：（1）將目的基因?qū)胛⑸锛毎?6頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日例：第27頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日

若通過基因過程生產(chǎn)人的糖蛋白可以用大腸桿菌作為工程菌嗎？

不可以，糖蛋白上的糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在真核細胞中，大腸桿菌是原核生物，細胞中不含這兩種細胞器。以酵母菌作為工程菌可以嗎?可以，酵母菌為真核生物（真菌類）。第28頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日①特點:

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：（2）將目的基因?qū)胫参锛毎芨腥倦p子葉植物和祼子植物,對單子葉植物沒有感染能力②過程：Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到其染色體上③適用生物：雙子葉植物、祼子植物。第29頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日Hind限制性酶ⅠⅡHindIIIHindIII目的DNATi質(zhì)粒蘇云金桿菌構(gòu)建表達載體Bt毒素蛋白基因

蘇云金桿菌DNA連接酶

T-DNA(可轉(zhuǎn)移-DNA)

知識拓展農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程：第30頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日培養(yǎng)培養(yǎng)導(dǎo)入含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌含有氨芐青霉素的完全培養(yǎng)基不能存活Ca2+

處理細胞形成感受態(tài)細胞檢測農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌（培養(yǎng)不具有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性積基因的農(nóng)桿菌）具有氨芐青霉素抗性基因的農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌不具有氨芐青霉素抗性基因的農(nóng)桿菌完全培養(yǎng)基含有氨芐青霉素的完全培養(yǎng)基農(nóng)桿菌證明：目的基因已導(dǎo)入存活第31頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日脫分化組織培養(yǎng)脫分化農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細胞通過組織培養(yǎng)產(chǎn)生新個體再分化移植個體生物學(xué)水平的鑒定如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達導(dǎo)入植物細胞組織培養(yǎng)第32頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛毎俨僮鞣椒ǎ孩谔攸c：

在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞十分簡便經(jīng)濟③例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉第33頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日基因槍法：

利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法①操作方法：②金屬粒：將目的基因?qū)雴巫尤~植物細胞

鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.6～4um。③適用：單子葉植物第34頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日①細胞類型：②操作程序：___顯微注射法：（3）將目的基因?qū)雱游锛毎l(fā)育成新性狀動物移植到子宮或輸卵管培養(yǎng)成早期胚胎顯微注射取受精卵提純含目的基因表達載體受精卵第35頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日四目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功

導(dǎo)入過程完成后，全部受體細胞都能攝入重組

DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。

目的基因進入受體細胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達？不一定，需要檢測1.檢測方法：分子雜交技術(shù)：（1）DNA分子與DNA分子的之間雜交（2）DNA分子與RNA分子的之間雜交（3）蛋白質(zhì)分子（抗原與抗體）之間雜交2.個體生物學(xué)水平的鑒定：抗蟲、抗病結(jié)種實驗，活性比較實驗第36頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日1.檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術(shù)變性變性第37頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日變性方法——DNA分子雜交技術(shù)（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N14N第38頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日提?。?）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)證明：提取蛋白質(zhì)與Bt毒素蛋白質(zhì)一樣第39頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。2.鑒定——個體生物學(xué)水平的鑒定（1）多細胞個體抗蟲、抗病結(jié)種實驗，活性比較實驗第40頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日

不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。第41頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物細菌的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)物的菌落，保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、研究。（2）單細胞生物第42頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日1、有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是()A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來

B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A課堂練習(xí)第43頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫中提?、蹚氖荏w細胞中提?、芾肞CR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥D(zhuǎn)課堂練習(xí)第44頁，共48頁，20