高效液相色譜的基礎(chǔ)知識

關(guān)于高效液相色譜的基礎(chǔ)知識第1頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜法的特點

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進行比較：第2頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜法的特點

1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達103cm·min-1.例如對氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。第3頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜法的特點2．高效液相色譜法與氣相色譜法（l）氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的20％。對于占有機物總數(shù)近80％的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進行分離和分析。

(2)氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個控制和改進分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。

(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。第4頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜法的特點分析速度快——通常分析一個樣品在15~30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。選擇性高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，可分析同類型的有機化合物及其同分異構(gòu)體，還可以分析在性質(zhì)上極為相似的旋光異構(gòu)體。靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達0.1pg。柱子可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。第5頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜法的特點

超高效液相色譜(UPLC)—是區(qū)別于HPLC的液相色譜新領(lǐng)域—基于小顆粒填料和LC原理的一種創(chuàng)新技術(shù)—實現(xiàn)超高分離度、靈敏度、分析速度第6頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日1高效液相色譜法的特點2高效液相色譜法儀器工作原理3高效液相色譜儀的維護4高效液相色譜法儀的注意事項5高效液相色譜的分析應(yīng)用第7頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理

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高壓輸液系統(tǒng)?

進樣系統(tǒng)?

分離系統(tǒng)?

檢測系統(tǒng)第8頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理

其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。第9頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理1．高壓輸液系統(tǒng)由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。對于一個好的高壓輸液泵應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差，它們各有優(yōu)缺點。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機械泵，它又分機械注射泵和機械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機械往復(fù)泵。第10頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理2．進樣裝置

第11頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理3分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備往內(nèi)徑較大，可達25mm以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。第12頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理4．檢測系統(tǒng)目前有兩種基本類型的檢測器:

一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，蒸發(fā)光散射，電導(dǎo)檢測器等。第13頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器

工作原理：基于Lambert-Beer定律，即被測組分對紫外光或可見光具有吸收，且吸收強度與組分濃度成正比。通用型檢測器約有80％的分析樣品具有紫外吸收,可以使用這種檢測器檢測。第14頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器

優(yōu)點:a:靈敏度高b:線性范圍廣C:對溫度和流速不敏感，適于進行梯度洗脫限制:a:沒有紫外吸收的物質(zhì)不能檢測b:應(yīng)盡可能選擇在檢測波長下沒有背景吸收的流動相(限制了一些截止波長在200~300nm之間的良好溶劑的使用)

第15頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器

原理:

物質(zhì)的分子或原子經(jīng)光照射后，有些電子被激發(fā)至較高的能級，這些電子從高能級躍至低能級時，物質(zhì)會發(fā)出比入射光波長較長的光，這種光稱為熒光。熒光檢測器就是在樣品的激發(fā)波長處檢測發(fā)射光的強弱.熒光檢測器是一種選擇性檢測器不到20%的物質(zhì)使用這種檢測手段,許多藥物采用這種檢測方法.

第16頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器優(yōu)點:a:靈敏度非常高(靈敏度在目前常用的HPLC檢測器中最高)，比紫外檢測器高2—3個數(shù)量級，適合于痕量分析

b:可以用于梯度洗脫

c:對儀器的穩(wěn)定性（如溫度和壓力的穩(wěn)定性）依賴較小

d:選擇性好，優(yōu)于紫外缺點:a:適用范圍有一定的局限性–只適用于有熒光基團＆衍生化之后有熒光基團的化合物

b:定量分析時線性范圍較窄它適合于稠環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素、蛋白質(zhì)等熒光物質(zhì)的測定第17頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器（3）二極管陣列檢測器原理:

光電二極管陣列（或CCD陣列，硅靶攝像管等）作為檢測元件的UV-VIS檢測器。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時檢測由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長的信號，然后，對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時間、光強度和波長的三維譜圖。

第18頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器（3）二極管陣列檢測器

第19頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器（3）二極管陣列檢測器與普通UV-VIS檢測器不同之處:a:普通UV-VIS檢測器是先用單色器分光，只讓特定波長的光進入流動池。而二極管陣列UV-VIS檢測器是先讓所有波長的光都通過流動池，然后通過一系列分光技術(shù)，使所有波長的光在接受器上被檢測.b:普通UV-VIS檢測器只能得到二維的譜圖,而DAD可以得到三維圖譜.

第20頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器（3）二極管陣列檢測器應(yīng)用a:色譜峰純度檢查b:色譜峰鑒定三維色譜能提供更多全面的信息。

第21頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器（3）二極管陣列檢測器（4）示差折光率檢測器是一種通用型檢測器，只要被測組分與洗脫液的折光指數(shù)有差別就可使用。生命科學(xué)中常遇到各類糖類化合物，沒有紫外吸收，一般常用示差折光檢測器。它的通用性比UVD廣，但靈敏度要低，對溫度變化敏感，并與梯度洗脫不相容，因而限制了它的使用。

第22頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器（3）二極管陣列檢測器（4）示差折光率檢測器（5）電導(dǎo)檢測器

電化學(xué)檢測器（ECD）ECD是根據(jù)物質(zhì)的電還原性和電氧化性來進行檢測的，應(yīng)用于對紫外光沒有吸收或不能發(fā)出熒光，但具有電活性的物質(zhì)測定。若結(jié)合衍生技術(shù)，也可應(yīng)用于非電活性物質(zhì)的檢測。安培檢測器和電導(dǎo)檢測器在生化、醫(yī)學(xué)、食品和環(huán)境分析中獲得廣泛的應(yīng)用。

第23頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日1高效液相色譜法的特點2高效液相色譜法儀器工作原理3高效液相色譜儀的維護4高效液相色譜法儀的注意事項5高效液相色譜的分析應(yīng)用第24頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀的維護

泵的使用和維護防止任何固體微粒進入泵體，因為塵埃或其它任何雜質(zhì)微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2μm或0.45μm）等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作第25頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀的注意事項柱的使用和維護1、使用前仔細閱讀色譜柱附帶的說明書，注意適用范圍，如pH值范圍、不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品。2、使用符合要求的流動相；3、使用保護柱；4、如所用流動相為含鹽流動相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。5、長時間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機相(如甲醇等)，因為純水易長霉。6、不要高壓沖洗柱子；7、不要在高溫下長時間使用硅膠鍵合相色譜柱；使用過程中注意輕拿輕放。第26頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀的維護

流動相的脫氣

HPLC所用流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結(jié)果帶來誤差。第27頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀的維護

紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器。第28頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日1高效液相色譜法的特點2高效液相色譜法儀器工作原理3高效液相色譜儀的維護4高效液相色譜法儀的注意事項5高效液相色譜的分析應(yīng)用第29頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀的注意事項一、流動相1、流動相應(yīng)選用色譜純試劑、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過濾后使用，過濾時注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍；2、水相流動相需經(jīng)常更換（一般不超過2天），防止長菌變質(zhì).第30頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀的注意事項二、樣品1、采用過濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒；2、用流動相或比流動相弱（若為反相柱，則極性比流動相大；若為正相柱，則極性比流動相?。┑娜軇┲苽錁悠啡芤海M量用流動相制備樣品液第31頁，共38頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀的注意事項三、操作過程1、先以所用流動相沖洗系統(tǒng)一定時間（如所用流動相為含鹽流動相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動相），正式進樣分析前30min左右開啟D燈或W燈，以延長燈的使用壽命；2、溶劑瓶中的沙芯過濾頭容易破碎，在更換流動相時注意保護，當(dāng)發(fā)現(xiàn)過濾頭變臟或長菌時，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌；3、實驗結(jié)束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過